鸡 PD 1胞外区基因的克隆表达及其蛋白生物学活性鉴定

为研究鸡程序性细胞死亡因子1（PD 1）胞外区的生物学活性,根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列,经生物信息学比对分析,设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物,扩增目的基因,连接原核表达载体 pET 28a（＋）,构建重组表达载体 pET 28a PD 1,转化至 Rosetta（DE3）大肠杆菌,并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析,应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示,成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因;SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明,37℃、0．1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时,PD 1胞外区融合蛋白表达量最高,以包涵体形式存在;流式细胞术分析结果表明,PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。     

转基因大豆及其深加工产品的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了从大豆及其深加工产品中检测转基因成分的方法。大豆及其深加工产品采用改良的CTAB法进行DNA提取纯化,大豆色拉油DNA则用试剂盒方法进行了提取纯化。对提取的DNA用PCR方法对大豆特异性内源基因lectin进行扩增,设计CaMV35启动子和NOS终止子特异性引物对其是否含有转基因成份进行初步的定性PCR筛选,并用抗除草剂基因CP4EPSPS对阳性结果进行确证。实验结果表明,改良的CTAB法对大豆深加工产品的DNA有很好的提取效果,而试剂盒方法对色拉油的DNA有良好的提取效果;PCR检测转基因的方法快速高效,检测结果与标准相符。     

鸡PD-1单克隆抗体的制备及生物学功能研究

试验旨在筛选并制备鸡PD-1单克隆抗体,对该单克隆抗体的免疫学特性、结合活性及其对鸡PD-1/PD-L1信号通路激活的阻断作用进行初步研究。运用杂交瘤细胞融合技术筛选杂交瘤细胞株,采用ELISA方法、Ig抗体亚型鉴定试剂盒、Western blotting鉴定抗体的免疫学特性,利用间接免疫荧光技术及流式细胞术检测筛选单抗与鸡PBMCs的结合情况,应用该单抗与IBDV感染7 d后的鸡PBMC细胞作用,利用实时荧光定量PCR技术检测IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子的表达情况。结果显示,试验获得1株特异、稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为PD-1-D05。该单克隆抗体的亚型属于IgG1,杂交瘤细胞培养上清和腹水的效价分别为1：2¹¹和1：2.048×10⁵。ELISA和Western blotting检测结果表明,PD-1-D05单抗能与免疫原发生特异性反应,与pET-28a （+）、Rosetta菌株蛋白提取液上清及无关蛋白无交叉反应。间接免疫荧光及流式细胞术检测结果显示,PD-1-D05单克隆抗体能与鸡PBMC特异性结合,且IBDV感染7 d后的PBMC经单抗处理后,IL-2表达量显著升高（P<0.05）,IFN-γ转录水平显著下降（P<0.05）,IL-6表达水平较IBDV攻毒组细胞虽有所下降,但并无统计学差异（P>0.05）。结果表明,试验成功筛选并制备了能够稳定分泌鸡PD-1单克隆抗体的细胞株,所获得的PD-1单克隆抗体具有良好的免疫学特性,该单抗能够特异性识别鸡PD-1分子并与鸡PBMC细胞特异结合,并在一定程度上恢复由于IBDV感染导致的PD-1/PD-L1信号通路激活引发的免疫调节相关细胞因子IL-2、IFN-γ的异常表达。     

IBDV感染鸡后外周血淋巴细胞PD-1及其配体PD-L1/PD-L2转录变化的初步分析

建立鸡PD-1及配体PD-L1/PD-L2SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,并用所建立的方法研究和分析雏鸡感染IBDV的不同阶段体内PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录变化。根据GenBank中PD-1、PD-L1和PD-L2的基因序列,分别设计特异引物扩增目的基因,得到各自阳性克隆质粒,以阳性质粒作为标准品建立标准曲线,并进行敏感性、特异性和重复性试验。应用所建立的实时荧光定量RT-PCR方法对4周龄健康雏鸡人工感染IBDV后第3、5、7、10天PBMC中PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录变化进行检测,同时用半定量RT-PCR方法以及IBDV快速检测试纸条对病毒感染后各时间点法氏囊组织中IBDV的载量进行检测。结果表明,建立的方法在1×101~1×109 copies·μL-1模板范围内具有良好的线性关系(R2>0.99),可检测至少101copies·μL-1的阳性标准样品,且具有较好的特异性和重复性。IBDV感染后,病毒在雏鸡体内复制逐渐增加,至第5天病毒载量达到最高。实时荧光定量RT-PCR检测结果表明,PD-1及配体PD-L1/PD-L2在病毒感染后不同阶段转录量均有所升高,其中PD-1在病毒感染后第7天显著(P<0.05)升高,在病毒感染后第3天PD-L1极显著(P<0.01)升高,PD-L2显著(P<0.05)升高。本研究成功建立了PD-1及配体PD-L1/PD-L2实时荧光定量RTPCR检测方法;并应用该方法初步分析了PD-1及配体PD-L1/PD-L2在IBDV感染不同阶段的转录变化,发现IBDV感染后不同阶段PD-1及配体PD-L1/PD-L2的转录均升高,且PD-L1、PD-L2的转录先于PD-1升高,并与病毒载量呈正相关。     

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。     

日粮添加不同水平的海藻对肉鸡生长性能、抗氧化及免疫性能的影响

文章旨在评估日粮添加不同水平的海藻对肉鸡生长性能、抗氧化及免疫性能的影响。试验将840只平均体重为（58.01±0.67）g的1日龄肉鸡随机分为4组,每组5个重复,每个重复42只鸡。对照组和处理组分别饲喂基础日粮+0、1.5%、2.5%和3.5%海藻,试验共开展42 d。结果：与对照组相比,3.5%海藻组42 d肉鸡体重显著提高1.39%（P＜0.05）,但22～42 d采食量及1～42 d料重比较对照组显著降低5.19%和4.80%（P＜0.05）。3.5%海藻组22～42 d肉鸡料重比较对照组和1.5%海藻组分别显著降低7.2%和5.69%（P＜0.05）。对照组血清胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白浓度显著高于3.5%海藻组（P＜0.05）,同时,对照组和1.5%海藻组血清总脂浓度较3.5%海藻组分别显著提高11.86%和7.73%（P＜0.05）。与对照组相比,处理组血清超氧化物歧化酶活性分别显著提高10.78%、12.49%和11.89%（P＜0.05）。与对照组相比,1.5%～3.5%海藻组42 d肉鸡抗绵羊红细胞抗体滴度分别显著提高20.63%、15.61%和18.52%（P＜0.05）。结论：在本试验条件下,综合考虑生长性能、血清抗氧化和抗体滴度,1～42 d肉鸡日粮中海藻适宜的添加水平为3.5%。 [关键词]海藻|肉鸡|生长性能|抗氧化|免疫性能     

西马特罗多克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立

为建立一种特异、敏感、快速、准确的西马特罗(Cimaterol,CIM)残留检测方法,成功合成其完全抗原并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立其免疫学检测方法。应用重氮化法偶联西马特罗与载体蛋白BSA、OVA,合成免疫抗原CIM-BSA和检测抗原CIM-OVA,并采用UV、SDS-PAGE、质谱3种方法进行完全抗原的鉴定。用CIM-BSA免疫新西兰大白兔制备抗西马特罗多克隆抗体并建立间接竞争ELISA检测方法。结果表明,成功合成了西马特罗完全抗原,具有合成抗原的分子特征;免疫新西兰大白兔后,成功制备了抗西马特罗多克隆抗体,其效价为1∶64 000,对西马特罗的半数抑制质量浓度为4.26μg/L,与特布他林、莱克多巴胺、沙丁胺醇、齐帕特罗等β_2型受体激动剂药物无交叉反应。经过条件优化,建立了西马特罗间接竞争性ELISA检测方法,其最低检测限为0.04μg/L,在0.1～12.8μg/L检测范围内,线性关系拟合度为R~2=0.977 1,拟合曲线方程为y=-0.246 9x+0.662 3。检测猪尿和饲料样品,回收率分别为96.3%～103.9%和67.0%～105.0%。综上,成功建立了具有良好应用前景的西马特罗间接竞争ELISA免疫学检测方法。     

新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。     

新城疫病毒xx08毒株血凝素-神经氨酸酶基因主要抗原区原核表达及鉴定

利用基因工程技术构建新城疫病毒HN基因抗原表位集中区HNI175-K367基因片段(523-1101位)的重组表达质粒pET32-HNI175-K367。将该质粒转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定表明,HNI175-K367蛋白得到高效表达,其分子量约为38kD。Western-blot分析证实,HNI175-K367蛋白与鸡新城疫病毒高免血清发生特异性反应,表明利用原核表达系统获得的重组蛋白具有良好的反应原性。     

齐帕特罗人工抗原合成及其多克隆抗体制备

为制备齐帕特罗(ZIL)完全抗原,获得抗ZIL多克隆抗体(pAb),将ZIL与4-溴丁酸乙酯反应后,采用EDC/NHS方法使ZIL-丁酸盐中间体与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)进行偶联,分别用紫外全波长扫描(UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定后,通过免疫新西兰大白兔获得抗ZIL多抗血清...