利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

表面展示猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)核定位序列部分缺失的ORF2基因(pdCap),将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的pBACsurf-1质粒中,得到重组质粒pBACsurf-1-pdCap。再将含有pdCap和gp64的融合基因克隆到杆状病毒并转移到质粒pFastBac^TM Dual中,得到重组质粒pFastBac-pdCap。然后将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组穿梭质粒Bacmid-pdCap。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-pdCap。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,该重组杆状病毒成功表达了具有良好反应原性的pdCap蛋白。     

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白和SEA共表达核酸疫的构建及鉴定

构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白和金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）共表达的核酸疫苗,并研究其表达产物的抗原性。将采自长春患PRRS病猪的组织剪碎充分研磨,提取病毒RNA后,用RT-PCR的方法特异性扩增PRRSV长春株的ORF6基因（M蛋白）片段。将该片段定向插入到载体pKS-SEA上,双酶切获得片段SEA-ORF6,再将其克隆到真核表达载体pVAXI中,构建重组质粒pVAXI-SEA-ORF6,转化大肠杆菌。经酶切鉴定后,将构建的阳性重组质粒在BHK细胞中表达。通过间接免疫荧光方法初步检测所表达蛋白的抗原性,用Western blot分析表达蛋白的特异性。结果表明,所构建的重组质粒pVAXI-SEA-ORF6在BHK细胞中得到了表达,为进一步研究PRRSV基因工程疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株ORF3基因的原核表达

通过 PCR方法从重组质粒 p GEM- ORF3扩增得到缺失 N端疏水序列的基因片段 d ORF3(deleting ORF3)。将d ORF3克隆至原核高效表达载体 p GEX- 4 T- 2 ,在 E.coli BL 2 1细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组蛋白GST- d ORF3,表达产物以包涵体的形式存在 ,表达量为 30 .6 % ,Western- Blot结果表明重组蛋白可被 PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究 PRRS病毒次要结构蛋白 GP3的免疫特性和功能奠定了基础     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTAORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

猪传染性胃肠炎病毒M、N基因重组杆状病毒的构建及其口服免疫小鼠诱导抗体水平测定

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)M和N结构蛋白基因,将其分别克隆入载体FastBacTM Dual,获得转移质粒pFastBacTM Dual-M和pFastBacTM Dual-N,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M和Bacmid-N;在Cellfection作用下,将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-N。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明,杆状病毒表达的M蛋白和N蛋白能够被特异性阳性血清识别,重组蛋白具有较好的反应原性。将重组杆状病毒rBac-M和rBac-N口服免疫小鼠,收集小鼠粪便检测抗TGEV sIgA抗体水平,采集血液检测血清中抗TGEV IgG。结果显示,重组杆状病毒(rBac-M和rBac-N)可诱导小鼠产生粘膜免疫和体液免疫应答。试验结果初步预示了杆状病毒经口服途径作为抗原递呈载体的可行性,也为开展TGEV口服免疫研究奠定了基础。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。