家蚕微孢子虫6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Nb6PGDH的克隆及表达特征分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。     

家蚕磷酸甘油醛异构酶Tpi基因的克隆

利用生物信息学方法成功地克隆了家蚕磷酸甘油醛异构酶(triosephosphateisomeraseTpi)基因(GenBank登记号为AY734490)。该基因全长为2875bp;含有5个外显子、4个内含子,所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG剪切模式;cDNA序列全长1051bp,并经RTPCR克隆和序列分析进行了验证;具有完整的开放阅读框架(ORF,95~839bp),可编码248个氨基酸的蛋白。通过与NCBI蛋白数据库的比对表明,该基因编码的蛋白为磷酸甘油醛异构酶(EC5311),参与葡萄糖分解代谢,即将磷酸二羟丙酮转化为3磷酸甘油醛,在果蝇、蚊子、黄粉虫、美洲淤夜蛾、棉铃虫等昆虫中具有高度的保守性。     

家蚕Bmsps1基因的克隆和原核表达

从家蚕EST数据中检索到果蝇(D.melanogaster)硒磷酸合成酶基因(patuf)的氨基酸序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕sps1的cds,用PCR克隆家蚕sps1基因序列.家蚕sps1基因cDNA长1817bp(登录号:ABA43639.1).利用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为94%,与大肠杆菌序列同源性最差为46%.Bmsps1基因在家蚕基因组中是单拷贝的,只有一个外显子.推导3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).同时我们对Bm sps1进行了原核表达研究.     

利用EST库资源克隆家蚕腺苷酸转移酶基因

根据物种间同源基因相对保守的特点 ,利用生物信息学方法以果蝇 (Drosophilamelanogaster)腺苷酸转移酶基因 (adeninenucleotidetranslocase,ant)cDNA序列作为模板 ,对家蚕 (Bombyxmori)EST数据库进行同源检索筛选 ,克隆了家蚕腺苷酸转移酶基因的cDNA序列 (GenBank登录号为AY2 2 70 0 0 ) ,全长为 1936bp ,并经RT PCR克隆、序列分析验证 ,结果与电子克隆序列完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架 (ORF ,2 0 7～ 110 9bp) ,推测编码蛋白为 30 0个氨基酸 ,通过与烟草天蛾 (Manducasexta)、蜜蜂 (Apismellifera)、绿蝇 (Luciliacuprina)、果蝇、蚊子(Anophelesgambiae)等昆虫的腺苷酸转移酶蛋白序列比较 ,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列 ,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选、拼接 ,是基因克隆的一条有效途径。     

民猪磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)基因部分片段的克隆与分析

试验采用比较基因组学结合克隆测序的方法首次获得了民猪的磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的第9,10,12内含子序列,并对测序结果进行了比对。结果表明:磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的第9内含子存在2个点突变(120 G→C和185 C→G),后者造成NlaⅢ酶切位点的缺失;第10内含子存在1个点突变(129 T→C),该点突变造成AceⅠ酶切位点的缺失;第12内含子处没有发现突变位点。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因的克隆及序列结构与表达研究

丙酮酸脱氢酶(PDH)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中的前件酶,参与生成柠檬酸循环(TCA)的起始物乙酰辅酶A,决定生物体内营养成分的分配。利用电子克隆、RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了与果蝇lethal(1)G0334基因类似的具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因。Bm-l(1)基因的cDNA全长为1 630 bp,由1 200 bp的完整ORF序列、186 bp的5'-UTR和207 bp的3'-UTR组成,含8个外显子和7个内含子,编码蛋白为399个氨基酸残基,分子质量43.93kD,pI 8.07。Bm-l(1)基因编码蛋白的69-365氨基酸残基为E1-dh结构域,该结构域为硫胺素焦磷酸依赖性脱氢酶所特有。蛋白质二级结构预测结果表明α螺旋占28.8%,β折叠占12.0%。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(1)基因编码蛋白与赤拟谷盗等昆虫的PDH具有63%以上的序列相似性,且保守区域高度一致。Bm-l(1)基因mRNA在家蚕整个卵期、幼虫期、蛹期和刚羽化的成虫中,以及5龄3 d幼虫的头部、丝腺、生殖腺、脂肪体、中肠和血液6种组织中都有较高的转录水平,且存在较小的组织差异性。     

家蚕sans fille基因的分子克隆及序列分析

生物性别决定是由一组基因通过级联网络来调控。果蝇sans fille(snf)基因在其性别决定过程中具有重要作用。结合生物信息学与分子生物学实验,成功克隆了家蚕的snf基因(Bm snf基因)。克隆的Bm snfcDNA全长915 bp,ORF长630 bp,编码209个氨基酸。该基因推定蛋白质的预测分子量为24 kD,等电点为9.75。将Bm snf的cDNA与家蚕基因序列进行比对,结果表明该基因具有5个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。比较家蚕snf和果蝇snf基因,显示两者编码氨基酸序列相似性为69.9%。通过SMART软件分析,家蚕snf和果蝇snf的RRM很相似。以上结果表明,家蚕snf很可能发挥了类似果蝇snf的作用。     

家蚕escargot基因的克隆及启动子活性鉴定

果蝇escargot(esg)基因作为表皮成组织细胞标记基因,可以指示果蝇成虫表皮形成过程。果蝇成虫雌较雄多1个体节,家蚕成虫与果蝇体节数相反。利用同源检索和RACE克隆获得果蝇esg在家蚕中的同源基因Bmesg,发现其ORF为1 128 bp,共编码375 aa。进一步克隆该基因上游约2 000 bp的调控序列esgp2k,细胞转染证明esgp2k有驱动活性。通过启动子截短及荧光素酶活性分析,证明起始密码子上游-270～-190 bp为esgp2k活性关键区域,并成功克隆长270 bp的核心启动子esgp7。上述结果为寻找家蚕成组织细胞潜在分子标记,进而研究家蚕雌雄体节数量差异的分子机制奠定了基础。     

与家蚕细胞凋亡相关的Caspase基因BmIce的克隆和序列分析

DrIce基因在果蝇的细胞调亡代谢途径中起着重要作用。采用tblastn程序将DrICE在家蚕EST数据库中进行同源性检索,检索到的EST序列进行电子延伸,根据延伸结果设计引物,用RT-PCR检测和克隆测序验证,成功地克隆到家蚕第二种Caspase基因的全长cDNA(GenBank登录号为:AY885228)。克隆的cDNA长1410bp,ORF长825bp,编码275个氨基酸残基,预测分子量为31.8kD,等电点为6.15,基因名定为BmIce。将BmIce的cD-NA与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。BmICE在氨基酸水平上与果蝇DrICE、线虫的CED-3的一致性分别为34%和29%,在第169个氨基酸残基处具有QACRG的五肽活性位点,该活性位点是Caspase家族的典型结构。与果蝇Caspase家族聚类分析中,BmICE与果蝇中具有短的N端结构域的DrICE、DCP-1及DECAY聚为一类,根据其结构分析和聚类分析,推测家蚕BmIce基因可能参与细胞凋亡的执行作用。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。     

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.     

奶山羊ACSL6基因克隆及表达调控分析

研究旨在获得西农萨能奶山羊长链脂酰CoA合成酶6（long-chain acyl-CoA synthetase 6，ACSL6）基因CDS序列，初步探究其对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的影响。以西农萨能奶山羊原代乳腺上皮细胞为试验材料，对ACSL6基因进行扩增和克隆，并利用实时荧光定量PCR方法对ACSL6基因进行组织表达分析，针对ACSL6基因的碱基序列利用在线软件进行生物信息学分析，采用RNA干扰技术改变奶山羊乳腺上皮细胞中ACSL6基因mRNA的表达水平。结果显示，ACSL6基因CDS区全长为2 169 bp，编码722个氨基酸；生物信息学分析表明ACSL6蛋白为碱性不稳定蛋白。组织表达分析显示，ACSL6基因在奶山羊乳腺组织中高度表达，其次为脾脏。将设计合成的siRNA转染乳腺上皮细胞，发现干扰ACSL6基因的表达使脂质代谢相关基因乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearyl-CoA dehydrogenase 1，SCD1）、脂肪酸转运蛋白36（cluster of differentiation 36，CD36）、固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins 1，SREBP1）的mRNA表达水平极显著下调（P<0.01）。本研究结果为从蛋白及个体水平上研究ACSL6基因对奶山羊乳腺脂质代谢的影响提供理论依据。     

水牛SIRT6基因克隆及其在组织中的表达分析

本研究旨在克隆水牛SIRT6基因，构建真核表达载体，并对该基因进行生物信息学及组织表达谱分析。以牛SIRT6基因编码区为种子序列（GenBank登录号：NM_001098084.1），应用Oligo 7.0软件设计引物序列，用RT-PCR方法扩增水牛SIRT6基因完整编码区序列，测序鉴定后进行生物信息学分析，构建逆转录病毒载体pMXs-SIRT6-IRES-GFP，并在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞上进行重组载体表达鉴定；采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴分别提取RNA，反转录后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测SIRT6基因在各组织中的表达差异。结果表明，水牛SIRT6基因编码区全长1 080 bp，编码359个氨基酸，其中亮氨酸及脯氨酸含量最高（10.3%），酪氨酸含量最低（1.1%）。水牛SIRT6基因核苷酸序列与牛、人和小鼠的同源性分别为98.4%、86.7%和78.5%，物种间同源性较低。系统进化树结果表明，水牛与牛聚为一支，再与人、小鼠聚为一大支，亲缘关系相对较近，与果蝇亲缘关系较远。SIRT6蛋白理论分子质量为39.47 ku，分子式为C₁₇₃₇H₂₇₈₃N₅₀₉O₅₁₆S₁₃，等电点为8.48，不存在跨膜区，为膜内蛋白；含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构。二级结构预测结果显示，水牛SIRT6蛋白包含13个α-螺旋、27个β-折叠、24个T-转角和20个无规则卷曲。逆转录病毒载体介导的SIRT6基因能在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞中表达。实时荧光定量PCR结果显示，SIRT6基因在水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴中均有表达，其中在生殖嵴中表达量最高，在皮肤中的表达量次之，而在肝脏中表达量最低。本试验结果将为水牛SIRT6基因的功能研究提供参考。     

ZBED6基因敲除猪肾脏转录组分析

【目的】 探究锌指BED结构域结合蛋白6(zinc finger BED domain-containing protein 6,ZBED6)基因敲除对猪肾脏组织基因转录表达的影响,并解析ZBED6基因调控猪肾脏代谢的靶基因及其通路。【方法】 对8月龄ZBED6基因敲除巴马香猪(ZBED6 KO)和同月龄野生型巴马香猪(WT)的肾脏组织(n=3)进行总RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和差异基因的表达量;以Illumina Hiseq高通量测序技术对ZBED6 KO和WT猪肾脏组织mRNA进行转录组测序(RNA-Seq),用猪Sus scrofa 11.1作为参考基因组序列,通过生物信息学软件TopHat、Cufflink、Cuffmerge和Cuffdiff对测序数据进行分析,筛选ZBED6 KO和WT猪肾脏组织中的差异表达基因,对差异表达基因进行层次聚类和KEGG通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果中差异表达基因的可靠性。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,ZBED6 KO猪肾脏IGF2基因mRNA表达量显著高于WT猪(P<0.05)。测序共获得78 G数据量,每个样本比对率在87.3%以上,测序质量良好;ZBED6 KO和WT猪肾脏组织之间共检测到25 213个基因,以调整后P<0.05和log₂|FoldChange|>2为筛选标准,得到299个差异表达基因,其中上调的基因103个,下调的基因199个。热图和主成分分析(PCA)结果显示,ZBED6 KO和WT组猪肾脏基因组内表达模式相似,组间表达模式不同;KEGG通路富集分析显示,差异基因主要参与视黄醇及疾病代谢相关通路。ZBED6基因敲除后,其中有9个差异表达基因(CYP2C42、AOX1、ENSSSCG00000036274、RDH16、CYP2A19、ENSSSCG00000022724、CYP26B1、CYP1A1、RDH5)被富集到视黄醇代谢通路中,可能参与调控猪肾脏代谢平衡。实时荧光定量PCR检测发现,7个差异表达基因(CYP2C42、AOX1、RDH16、CYP2A19、CYP26B1、CYP1A1、RDH5)的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实RNA-Seq结果的可靠性。【结论】 本试验利用RNA-Seq技术分析了ZBED6基因敲除对巴马香猪肾脏代谢的影响,其通过调控肾脏多个下游基因表达,从而影响其代谢相关信号通路,试验结果为阐明ZBED6基因功能提供了材料。     

ZBED6基因对巴马香猪脾发育的作用机制分析

ZBED6基因作为一个转录因子,能够与IGF2结合进而调节肌肉的生长发育。但其在脾生长发育中的作用尚不清楚,本研究利用RNA-seq测序技术比较ZBED6基因敲除巴马香猪（ZBED6-KO）和同日龄野生型巴马香猪（WT）的脾组织转录组,探究ZBED6基因对巴马香猪脾组织的发育影响。利用t检验对ZBED6-KO猪和WT猪脾组织大小的表型差异及ZBED6直接调控的靶基因IGF2的表达量进行显著性分析。提取ZBED6-KO猪和WT猪脾组织的总RNA,在Illumina Hiseq 2500平台进行RNA-seq分析。以猪Sus scrofa11.1为参考基因组,用转录组分析的标准流程筛选ZBED6-KO猪和WT猪脾组织中的差异表达基因。用DAVID在线网站对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。然后,随机选取7个差异表达的基因,利用实时荧光定量PCR技术验证测序结果的准确性与可靠性。结果显示,与WT猪相比,ZBED6-KO猪脾的重量和IGF2基因表达量均显著增加（P<0.05）,表明ZBED6基因的敲除对巴马香猪脾组织的生长发育有一定的促进作用。测序结果显示,各样本至少获得4G的数据量,每个样本的Clean Ratio及Q30比率均在90%以上,83.94%以上的reads可比对在猪的参考基因组上,表明测序数据质量良好,真实可靠;对测序数据进行转录组分析,共筛选到161个差异表达基因,其中上调基因90个,下调基因71个;差异表达基因的层次聚类分析显示,ZBED6-KO猪的3个个体（spleen1、spleen3、spleen6）的表达模式相似,WT的3个个体（spleen2、spleen4、spleen5）的表达模式相似,进一步证明测序数据的准确可靠;GO和KEGG富集分析中,富集到10条显著的GO条目以及5条显著的信号通路,2条与肌肉发育相关的通路;实时荧光定量PCR试验随机检测7个差异表达基因的表达模式与RNA-seq分析结果相一致,证实了测序数据的可靠性。以巴马香猪为模型,利用RNA-seq技术研究ZBED6基因的敲除对中国地方猪脾发育的作用影响,为挖掘ZBED6基因的更多功能提供了基础。     

牦牛Myf6基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在克隆牦牛Myf6基因,进行生物信息学分析并探究其在牦牛不同时期的表达情况。以青海雪多牦牛为研究对象,通过设计引物对其Myf6基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测研究。结果显示,牦牛Myf6基因含有一个大小为729 bp的开放阅读框（ORF）,编码242个氨基酸。同源性比对和进化树分析结果表明,牦牛Myf6氨基酸序列与普通牛、绵羊亲缘性最近。对Myf6蛋白理化性质进行预测分析得到其结构式为C₁₁₆₇H₁₈₇₀N₃₃₆O₃₇₂S₁₃,理论等电点为5.64,其中丝氨酸含量最高,其次是亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸;其疏水平均值为-0.586,亲水性最强为-2.467,疏水性最强为1.511,为亲水性、可溶性蛋白;有可形成卷曲螺旋部位;磷酸化位点预测其有26个丝氨酸激酶,10个苏氨酸激酶,5个酪氨酸激酶;亚细胞定位分析其编码产物在细胞核中分布最多（73.9%）,其次为细胞骨架（13.0%）、细胞质（4.3%）、高尔基体（4.3%）、分泌系统小泡（4.3%）。蛋白质二级结构主要由无规则卷曲（49.17%）组成,其次是α-螺旋（33.47%）、延伸连（11.57%）及β-折叠（5.79%）。蛋白功能分析显示其生长因子功能几率较大（7.694）,其次为转录调节作用,预测其作为一种生长因子参与机体生物学调控。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在胎牛、6月龄、4~5岁牦牛背最长肌中均有表达,且在6月龄的表达量显著高于胎牛和4~5岁牦牛（P<0.05）。上述结果为研究牦牛Myf6生肌因子提供了重要的研究数据,为改良牦牛经济性状提供了参考。     

蒺藜状苜蓿中MtERF-6基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对蒺藜状苜蓿Medicago truncatula测序的数据库进行分析,设计合成引物,通过RT-PCR扩增得到了乙烯反应元件结合蛋白基因(MtERF-6),并测定了其核苷酸全序列.该基因完整的读码框包括654 bp,编码218个氨基酸.用此片段的氨基酸序列通过GenBankBLAST分析表明,该基因属于EREBP(Ethylene responsive element binding proteins)家族,其核苷酸与已报道的ERF4[Gossypium hirsutum]、ATERF-9[Arabidopsis thaliana]、NtERF3[Nicotiana tabacum]、NsERF3[Nicotiana sylvestris]、CaEREBP-C1[Capsicum annuum]的相似性分别为45%、47%、41%、40%和42%,是新的基因.MtERF-6的核酸序列在GenBank发表,登录号为DQ344024.     

猪白细胞介素2／6嵌合基因的融合表达及活性

采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。