三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究

为探究三穗麻鸭丝切蛋白2(Cofilin2)基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。     

亚洲黑熊源阴沟肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为明确贵阳市某公园动物园1只亚洲黑熊死亡的原因,本试验采集死亡黑熊内脏器官,进行细菌分离培养、菌体形态观察、生理生化鉴定、16SrRNA基因序列分析和小鼠感染试验。结果显示,从死亡黑熊肺脏样本分离出一种圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、中等大小的乳白色菌落,经染色镜检为呈单在或双排列的革兰氏阴性小杆菌。该分离菌可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和枸橼酸盐,不发酵乳糖,不产生硫化氢,精氨酸脱羧酶阳性,赖氨酸脱羧酶阴性,符合阴沟肠杆菌生化特征。经细菌16SrRNA通用引物扩增,可得到大小为1 419bp的片段,与NCBI上相应序列进行BLAST比对,结果显示与阴沟肠杆菌序列相似度达99.9%,确认该分离菌为阴沟肠杆菌。用该分离菌腹腔接种小鼠,可致死小鼠,半数致死量(LD50)为7.94×108 CFU/mL。药敏试验发现,该分离菌对丁胺卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星等常用抗菌药均保持较高的敏感性。本试验结果表明,阴沟肠杆菌是导致该亚洲黑熊死亡的病原。     

从江县鲤爆发性死亡病例实验室诊断

2018年10月贵州省从江县某水产养殖专业合作社鲤爆发死亡,本研究对死亡病例进行了流行病学调查、病理学观察、寄生虫学检查、细菌分离鉴定和病毒PCR检测等诊断。结果显示:病鲤病变以鳃丝溃烂、体表出血、肛门红肿和眼球凹陷为主要特征,组织的主要病变是肾小球萎缩出血、肾小囊空腔、鳃丝肿胀粘连及上皮细胞脱落等;细菌分离培养可得到圆形凸起、表面光滑的灰白色菌落,经染色镜检、生理生化鉴定和16S rRNA基因测序分析,鉴定该分离菌为嗜水气单胞菌;PCR检测显示鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)为阳性,未检出鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)和鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV);显微镜观察亦未见到寄生虫虫体;分别取分离菌和鲤浮肿病毒阳性病例组织悬液进行人工感染试验,均可引起健康鲤发生死亡。上述结果表明,从江县鲤的死亡是嗜水气单胞菌和鲤浮肿病毒混合感染所致。     

蛋白激酶C抑制剂及激活剂对鸭肠炎病毒增殖的影响

为进一步探究鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)的致病机理,试验采用鸭蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的抑制剂星形孢菌素(staurosporine,SP)和激活剂佛波醇(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)研究PKC/PKCI能否对DEV的增殖产生影响,为阐述DEV致病机理提供新的思路。用SP/PMA处理正常鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)后,实时荧光定量PCR方法检测不同时间段PKC/PKCI基因表达;用DEV病毒液感染SP/PMA处理的DEF后,收集不同时间段培养物,以Reed-Muench法计算DEV半数组织培养感染量(TCID50)值,实时荧光定量PCR方法检测分析DEV NP基因转录水平。结果显示,SP处理对宿主细胞PKC/PKCI基因表达水平无显著影响(P0.05);而PMA处理可极显著提高宿主细胞PKC基因表达(P0.01),但对PKCI基因表达水平无显著影响(P0.05);SP/PMA处理对DEV复制能力影响显著(P0.05;P0.01),且在感染前期可显著或极显著降低DEV NP基因的转录水平(P0.05;P0.01)。综上所述,SP和PMA对PKC、PKCI基因表达水平的影响效果不同,且都能有效抑制DEV增殖,本试验结果可为DEV的防控及其致病机理的研究提供基础资料。     

鸭源NF-κB1基因荧光定量PCR方法建立及其初步应用

为建立鸭NF-κB1(nuclear factor-kappa B, NF-κB)基因的荧光定量PCR检测方法,并以建立的方法检测鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblasts , DEF)在感染鸭肠炎病毒(DEV)后NF-κB1基因随时间变化转录表达量的变化情况。根据GenBank 上NF-κB1基因保守序列设计特异性引物,以鸭胚成纤维细胞 mRNA提取样本反转录为cDNA,进行NF-κB1基因克隆质粒构建,以此为模板建立鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法并进行特异性、重复性和敏感性试验,并利用建立的方法DEF感染DEV后NF-κB1基因随时间变化的转录变化进行检测。结果显示:建立的鸭NF-κB1基因荧光定量PCR方法标准曲线呈现典型的S型,方程为y=-3.12x+44.086(R²=1),扩增效率为109.2%;其熔解温度Tm值为(83.5±0)℃,曲线呈特异性单峰,批内变异系数小于0.3%,批间变异系数小于0.2%;检测灵敏度可达到1.79个拷贝。DEF细胞在感染DEV后NF-κB1基因随时间改变转录水平变化无规律,但整体表达水平高于正常细胞,差异显著(P<0.05),36~84 h NF-κB1基因的转录水平与正常细胞中差异极显著(P<0.01)。本研究成功建立了鸭NF-κB1基因荧光定量PCR检测方法,并对DEF细胞感染DEV后NF-κB1基因的转录水平进行了研究,为后续实验研究提供了技术和数据支撑。     

亚洲黑熊源阴沟肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为明确贵阳市某公园动物园1只亚洲黑熊死亡的原因,本试验采集死亡黑熊内脏器官,进行细菌分离培养、菌体形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析和小鼠感染试验。结果显示,从死亡黑熊肺脏样本分离出一种圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、中等大小的乳白色菌落,经染色镜检为呈单在或双排列的革兰氏阴性小杆菌。该分离菌可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和枸橼酸盐,不发酵乳糖,不产生硫化氢,精氨酸脱羧酶阳性,赖氨酸脱羧酶阴性,符合阴沟肠杆菌生化特征。经细菌16S rRNA通用引物扩增,可得到大小为1 419 bp的片段,与NCBI上相应序列进行BLAST比对,结果显示与阴沟肠杆菌序列相似度达99.9%,确认该分离菌为阴沟肠杆菌。用该分离菌腹腔接种小鼠,可致死小鼠,半数致死量（LD₅₀）为7.94×10⁸ CFU/mL。药敏试验发现,该分离菌对丁胺卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星等常用抗菌药均保持较高的敏感性。本试验结果表明,阴沟肠杆菌是导致该亚洲黑熊死亡的病原。     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

不同滴度鸭肠炎病毒感染对鸭脾脏的转录组变化分析

为探讨不同滴度鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)感染对鸭组织器官转录组的影响,本研究采用2个不同DELD50滴度的DEV,接种50日龄健康鸭90h后,采集脾脏样本,高通量测序技术进行转录组测序,筛选差异表达基因,并应用GO与KEGG数据库进行分析。结果显示,当接种量为100×DELD5 0时,鸭脾脏差异表达基因有685个,其中上调基因341个,主要参与免疫反应、核糖体结构和酶活性等生物学过程,并在核糖体、氧化磷酸化和吞噬体信号通路中显著富集;下调基因为344个,主要参与细胞分化正调控、β转化生长因子生成正调控、酶与相关受体活性、细胞结构等生物学过程,并在细胞黏附分子、内吞作用、肠道免疫网络IgA产生、ECM受体互作、缝隙连接和黏着信号通路上显著富集。当接种量为10-2×DELD50时,鸭脾脏差异表达基因有485个,其中上调基因297个,主要参与细胞功能、蛋白结合和蛋白复合物等生物学过程,并在细胞黏附分子、吞噬体、肠道免疫网络IgA产生、球系列鞘糖脂生物合成及N-糖链合成信号通路中显著富集;下调基因188个,主要参与补体激活、肌肉组织活动调节、受体复合物、酶与受体活性等生物学过程,并在基础转录因子、PPAR信号通路、α-亚麻酸代谢等代谢途径与信号通路上显著富集。这些结果表明不同滴度DEV感染对鸭脾脏转录组产生不同的影响,为深入探究DEV致病分子机制提供基础资料。     

三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究

为探究三穗麻鸭丝切蛋白2（Cofilin2）基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498 bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。     

鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立鸭白细胞介素-1β(IL-1β)基因的实时荧光定量PCR检测方法,并检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平,试验根据GenBank上鸭IL-1β基因序列设计特异性引物,以鸭IL-1β基因克隆质粒为模板,SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因的转录水平。结果表明:建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的熔解曲线为特异性单峰,标准曲线方程为y=-3. 329x+39. 731,扩增效率为99. 7%,相关系数为1,批内重复变异系数小于1. 00%,批间重复变异系数小于2. 00%;实时荧光定量PCR方法的检测敏感性是普通PCR方法检测敏感性的1 000倍;以该方法进行检测发现,鸭的法氏囊、肺脏、肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、十二指肠、心脏和胸腺中IL-1β基因mRNA含量分别为428. 45,973. 43,1 394. 19,568. 22,551. 54,839. 91,2 586. 22,1 161. 92,459. 17,3 276. 16 copies/μL,其中胸腺中含量最高,而法氏囊中含量最低。说明试验建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好和敏感性高等特点,可用于鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平的检测分析。