ZBED6基因敲除猪肾脏转录组分析

【目的】探究锌指BED结构域结合蛋白6(zinc finger BED domain-containing protein 6,ZBED6)基因敲除对猪肾脏组织基因转录表达的影响,并解析ZBED6基因调控猪肾脏代谢的靶基因及其通路。【方法】对8月龄ZBED6基因敲除巴马香猪(ZBED6 KO)和同月龄野生型巴马香猪(WT)的肾脏组织(n=3)进行总RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和差异基因的表达量;以Illumina Hiseq高通量测序技术对ZBED6 KO和WT猪肾脏组织mRNA进行转录组测序(RNA-Seq),用猪Sus scrofa 11.1作为参考基因组序列,通过生物信息学软件TopHat、Cufflink、Cuffmerge和Cuffdiff对测序数据进行分析,筛选ZBED6 KO和WT猪肾脏组织中的差异表达基因,对差异表达基因进行层次聚类和KEGG通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果中差异表达基因的可靠性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,ZBED6 K...     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。     

CRISPR/Cas9系统在猪基因编辑中的研究进展

随着基因编辑技术不断发展,从最初的同源重组到现在的CRISPR系统,基因编辑的操作步骤得到简化,编辑效率得到提高且降低了成本。CRISPR/Cas9系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑,CRISPR/Cas9技术操作简单、定位准确,近年来被广泛使用。本文主要介绍CRISPR/Cas9系统,并对该系统在猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植4个方面的应用研究进行综述。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展

随着科学的进步,基因编辑技术得到不断发展,从同源重组与第一代人工核酸内切酶(ZFN)到第二代内切酶转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN),再到如今出现的CRISPR/Cas9技术,基因编辑工具得到进一步的发展,降低了成本,简化了操作步骤,提高了作用效率。该文简述了基因编辑技术的发展进程以及最新编辑技术CRISPR/Cas9的应用情况、问题和前景。     

CRISPR/Cas系统作用机制及其在寄生虫学研究中的应用

CRISPR/Cas系统是一种存在于细菌和古细菌的免疫系统,该系统包括能靶向入侵宿主的病毒或外源DNA核酸片段的RNA和切割该片段的Cas9核酸酶。与其他基因编辑技术相比,该系统更易操作,效率更高,成本更低,被广泛应用于各种基因工程领域。作者综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及其在寄生虫方面的应用。     

CRISPR/Cas9技术及其在猪基因编辑中的应用

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9)是一种新型基因编辑系统,是由细菌和古细菌对抗入侵病毒及外源DNA的适应性免疫防御系统演变而来的。该系统具有简易、精准、经济和高效的优点,目前已广泛应用于基因编辑及其相关研究中。本文总结了近几年CRISPR/Cas9技术在猪基因组编辑中的研究进展,并展望了其应用前景。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Prdx6基因敲除的RAW264.7细胞系

利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。     

基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。该系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统,与TALEN和ZFN技术设计相比更加简单、更容易操作,目前,该技术已成功应用于人类细胞、细菌、斑马鱼、猪、小鼠、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰,是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。     

猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD...     

猪的基因编辑技术现状与展望

利用基因编辑技术能够定向改造生物体基因组,改变遗传信息,获得理想的表型特征。基于核酸内切酶的基因编辑技术在近几年得到了迅猛发展,已经被广泛应用到多种生物体中。从微生物,植物,到动物,灵长类以及人类胚胎,都得到了较成功的应用,充分体现了基因编辑技术巨大的潜在价值和应用前景。文章以猪为例,阐述目前被广泛应用的基因编辑技术及其制备的基因编辑猪的现状,以及存在的问题和发展前景。     

Mechanism of CRISPR/Cas System and Its Application in Parasitology

CRISPR/Cas system is an immune system present in bacteria and archaea that includes the RNA which has the ability to target viruses invading the host or exogenous DNA fragment of the nucleic acid and the Cas9 nuclease cutting the fragment. In view that the system is easier to operate, more efficient, lower cost, has been widely used in various fields of genetic engineering. Here, we demonstrated the mechanism of CRISPR/Cas systems and summarized the application in respect of the parasite.     

巴马香猪CIDEa基因克隆及组织表达分析

本试验旨在对巴马香猪CIDEa基因序列进行克隆,预测其蛋白结构和功能,并进行组织表达分析。根据NCBI已经公布猪的CIDEa基因序列(登录号:NM_001112696.2),利用Oligo 7.0软件设计引物,采用RT-PCR法扩增并克隆巴马香猪CIDEa基因序列,利用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码蛋白的疏水性、理化性质、跨膜结构域、二级结构、三级结构及互作蛋白,并采用实时荧光定量PCR方法检测CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、背最长肌及心脏的表达规律。结果显示,试验成功获得巴马香猪CIDEa基因CDS区序列,全长660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank中猪、牛、马、犬、人、猕猴和家鼠的核苷酸相似性分别为99.4%、84.7%、81.5%、80.9%、79.7%、78.9%和76.1%。与GenBank中野猪CIDEa基因核苷酸序列比对发现,发生4处碱基突变,其中A609G和T627C位点为同义突变,C173T(Pro→Leu)和C631T(Arg→Cys)位点为错义突变。巴马香猪CIDEa蛋白分子质量为24 483.57 u,等电点为9.48,不稳定指数为52.86,属于不稳定蛋白;该蛋白中亮氨酸(Leu)含量最高(13.2%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)。巴马香猪CIDEa蛋白为膜外亲水性蛋白,包含1个超家族结构域(CIDE-N)。二级结构预测发现,巴马香猪CIDEa蛋白包含α-螺旋(45.66%)、β-转角(5.94%)、延伸链(14.61%)和无规则卷曲(33.79%),三级结构预测结果与二级结构一致。蛋白互作分析结果表明,巴马香猪CIDEa蛋白与PPARG、PPARGC-1、COX8H、PRDM16、DIO2、TMEM26、ELOVL3、COX7A1、CIDEC、DFFB蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,CIDEa基因在巴马香猪皮下脂肪中表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.05),心脏中表达量最低。研究结果为进一步探讨CIDEa基因对巴马香猪脂肪沉积的调控机制提供理论依据。     

CRISPR/Cas9系统在寄生原虫基因编辑中的应用

原虫生活史复杂,大部分难以通过体外培养完成整个生活史,缺乏高效的基因编辑系统。CRISPR/Cas9系统可以通过人工设计的方式,实现基因的精确、高效、快速编辑,被广泛应用于基因工程各个领域。CRISPR/Cas9系统为原虫的未知功能基因研究开辟了新途径。本文介绍CRISPR/Cas9系统的原理和目前在寄生原虫中的基因定位、基因功能研究、高通量基因家族筛选等方面的应用。     

家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术,在向导RNA （gRNA）的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因,实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究,尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒（MDV）基因组以来,短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果,并对其面临的问题和前景进行了展望,以期为后续研究提供重要参考。     

CRISPR/dCas9技术在基因表达调控中的研究进展

CRISPR/dCas9是在CRISPR/Cas9基因编辑系统的基础上改造升级建立起的一种用于调控基因组转录与表观遗传修饰的系统,它不仅继承了CRISPR/Cas9系统的精准性,同时还展现出了良好的作用效果。在该系统中dCas9蛋白保留了Cas9蛋白结合DNA的能力而切割功能不复存在。将dCas9蛋白与不同的激活、抑制效应子域和表观遗传调控酶偶联,可以对基因表达与表观遗传修饰进行精确调控。组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、DNA甲基化等表观遗传修饰过程是基因表达的基础,对整个生命过程作出了巨大的贡献,同时表观遗传与多种疾病和癌症都存在因果关系,因此以CRISPR/dCas9系统为框架的不同表观遗传修饰系统在人类疾病治疗和癌症研究领域具有重要的研究价值。笔者简要介绍了CRISPR/Cas9系统的发现过程以及作用原理,主要总结了以CRISPR/dCas9系统为框架的不同调控系统在基因表达调控和表观遗传调控中的应用以及优化过程,以期为从事相关领域的科研工作者提供一些参考。