伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRY基因缺失疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-／gE^-／GP5^＋免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力，本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因，构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-／gE^-／GP5m^＋。经PCR、Southem Blot、Western blot证实构建正确，并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TX^-／gE^-／GP5m^＋与TK^-／gE^-／GP5^＋分别免疫Balb／c小鼠，结果TK^-／gE^-／GP5m^＋免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体（3／6只达到了1：16），而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-／gE^-／GP5^＋，表明TX^-／gE^-／GP5m^＋是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。     

伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株（PRV-Ea）为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。     

智能故障定位系统应用的经验

正山区的配电线路传输距离远、支线多,大部分是架空线路,环境和气象条件恶劣,树木碰触、外力破坏、设备故障和大风、雷电袭击等常常造成线路故障。一旦出现故障停电,查找故障便非常困难。不少供电企业使用了架空线路智能故障定位系统,通过该系统一般能迅速查出故障点,提高故障查找效率,降低一线故障查找人员的劳动强度,缩短停电时间,提高供电可靠性     

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因工程疫苗，以伪狂犬病毒（PRV）gE基因缺失标志疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为病毒载体，通过同源重组，构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22（BHV-1 VP22）融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确，并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB／c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应，并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-／gE^-／E^＋与TK^-／gE^-／E^＋／M^＋进行比较。结果显示TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应，BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。     

快速智能故障定位系统在山区故障查找中的应用

正山区配电线路传输距离远,支线多、大部分是架空线,环境和气候条件恶劣,树木、外破、设备故障和雷电等自然灾害常常造成故障率较高。一旦出现故障停电,首先给人民群众生活带来不便,干扰了企业的正常生产经营;其次给供电公司造成较大损失;再者一条线路距离较长,分支又多,呈网状结构,查找故障,非常困难,浪费了大量的人力,物力。同时,由于是山区线路,有时看得见但过不去,甚至可能会引发安全生产事故等。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.     

修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上，进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCl-52M。间接免疫荧光证实体外表达后，免疫BALB／c小鼠，检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体，并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCl-52进行比较。结果表明，修饰后的DNA疫苗pCl-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCl-52，是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。     

伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.     

浙江金华地区PCV2分子流行病学调查及遗传变异分析

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)主要引起猪的多系统功能障碍性疾病,同时,还可侵害猪的免疫系统,造成猪免疫抑制,容易继发细菌及其他病毒感染,大大增加猪群的死亡率。为了解PCV2在浙江金华猪群中的分布与流行状况以及PCV2变异规律,对从浙江省金华猪场收集的3 433份血清进行PCR检测,结果显示,2012-2018年PCV2阳性率分别为10.16%,11.95%,8.50%,9.94%,6.19%,5.94%,8.28%,母猪阳性率最高为13.49%。本研究发现在2012年浙江金华地区PCV2优势毒株已经由PCV2b变为PCV2d,且全部为PCV2d-2。将得到的ORF2序列同已知的疫苗序列对比后,发现SH株与浙江金华目前PCV2主流毒株序列一致性最高,但抗原位点比较仍有5处差异,这可能会对疫苗效果产生影响,需要进一步验证。另外只有PCV2d在免疫显性诱饵表位上发生了突变,这可能是PCV2d成为主流的原因。