伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株（PRV-Ea）为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。     

H_5亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫效果评价试验

选取我省中标的两种类型6个批次的H5亚型禽流感病毒灭活疫苗,双盲条件下,在黄羽肉鸡中进行免疫效果比对试验。于14、35天龄进行两次免疫,在21、28、35、42、49、56、63、77、91、105和113 d进行抗体检测,结果全期平均免疫抗体水平超过6l og2,各批次疫苗间的免疫抗体水平略有差异。本次试验初步明确了H5亚型禽流感灭活疫苗接种后的抗体消长规律,为疫苗选择和免疫程序的制定提供依据。     

伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.     

广东省仔猪病毒性腹泻横断面研究

[目的]估计广东省规模化猪场仔猪病毒性腹泻(PVD)的群体流行率,分析PVD发生的风险因素。[方法]2013年12月—2014年3月,对广东省197个规模化猪场进行调查和横断面分析研究。[结果]调查发现:广东省规模化猪场的PVD场流行率为48.55%(95%CI:42.27%~56.21%)。PVD流行与猪场规模(OR=1.340,P=0.020)、外来人员进入生产区(OR=4.740,P=0.007)、距县级以上公路距离(OR=0.389,P=0.008)、病死猪无害化处理与否(OR=0.244,P=0.035)有关联。多元logistic回归分析发现:参观者进入生产区(OR=5.003,95%CI:1.555~16.096,P=0.007)是发生PVD的风险因素;免疫猪流行性腹泻和传染性胃肠炎(PED+TGE)二联灭活疫苗(OR=2.012,95%CI:1.035~3.912,P=0.039)、未进行病死猪无害化处理(OR=0.306,95%CI:0.080~1.175,P=0.084)、距县级以上公路距离过近(OR=0.530,95%CI:0.080~1.175,P=0.090)可能是混杂因素。[结论]本研究弄清了广东省规模化猪场PVD的场流行率,确定了参观者进入生产区是发生PVD的风险因素,提示生物安全措施对PVD控制的重要性。     

4个厂家不同批次猪瘟疫苗免疫效果比较试验

在同一条件下对4个厂家生产的8个批次的猪瘟原代细胞苗进行了免疫效果评价试验,并与猪瘟传代细胞苗免疫效果进行比较。结果发现4个厂家生产的猪瘟原代细胞苗二次免疫效果较好,但部分厂家存在批间差异、质量不稳定现象。猪瘟传代细胞苗免疫效果优于猪瘟原代细胞苗。     

一起水牛出血性败血症的暴发调查

2013年8月28日,广东省四会市某村报告了水牛死亡事件。为了弄清水牛发病的状况,查明发病原因,有效控制疫情,开展了本次现场调查。调查表明:本次疫情的袭击率为9.48%(11/116)、病死率为81.82%(9/11)、群流行率为11.54%(6/52)。初步诊断为多杀性巴氏杆菌引起的牛出血性败血症。通过病例-对照研究发现,出现病例前的舍饲点(P<0.01)、养牛户同时饲养犬(P<0.01)与水牛发病有关联。本次疫情具有舍饲点聚集性,购入牛只可能导致疫病传入,村内犬的活动可能对疫病传播起着媒介作用,气象因素对该病的发生起着诱导作用。建议引进牛只应先隔离观察,加强对牛多杀性巴氏杆菌的免疫接种,做好粪便的无害化处理。     

三个厂家猪瘟活疫苗免疫效果比较试验

在同一条件下对3个厂家生产的猪瘟细胞源活疫苗进行了免疫效果评价试验,并与猪瘟传代细胞苗免疫效果进行比较。结果发现3个厂家生产的猪瘟细胞源活疫苗存在一定差异,2个厂家的免疫效果较好,1个厂家的免疫效果较差。猪瘟传代细胞苗免疫效果优于猪瘟细胞源活疫苗,猪瘟传代细胞苗免疫1次,抗体合格率高,持续时间长,猪瘟细胞源活疫苗要免疫两次才能获得比较好的效果。同时,我们发现高致病性猪蓝耳病活疫苗（JXA1-R株）对猪瘟抗体产生有一定影响。     

四个不同厂家高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)免疫效果比较试验

对广东省2011年政府招标的4个厂家生产的高致病性猪蓝耳病活疫苗(J XA1-R株)进行免疫效果比较试验。随机选取115头32天龄,猪蓝耳病病毒核酸阴性的健康仔猪,随机分成4组,于免疫前0 d,免疫后28 d、48 d、66 d、86 d、106 d和126 d分别进行采血,采用法国LSI公司猪蓝耳病抗体ELISA试剂盒进行抗体检测,比较4个厂家生产疫苗的免疫效果。检测结果表明,4个厂家生产的高致病性猪蓝耳病活疫苗(J XA1-R株)免疫效果都比较好,无明显不良反应,免疫持续期长,一次免疫后126d抗体阳性率仍在75%以上。     

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.