湖南某猪场保育猪高死亡情况分析

为了查明湖南省某猪场保育猪厌食、发烧、咳嗽、皮肤发绀致保育猪死亡的原因,采用临床症状观察、现场剖检及实验室PCR检测等方法,结果表明,送检病死保育猪发病是由猪繁殖与呼吸综合征类NADC-30毒株和HP-PRRSV毒株及猪圆环病毒2型混合感染,继发细菌性疾病,应采取相应的治疗及预防措施,降低该病造成的损失。     

伪狂犬病病毒Bartha株TK-/LacZ+突变株的构建及其生物学特性研究

本研究将伪狂犬病病毒Bartha株基因组与含有LacZ标志基因的TK基因转移质料pUEKPZ共转染猪肾传代细胞PK－5，细胞出现病变后，反复冻融3次收毒，按1：5稀释接种于IBRS－2细胞。在X－gal存在下挑取蓝斑，蓝斑筛选3次，再进行空斑试验，同时用PCR扩增LacZ基因，经3次空斑纯化，随机挑取的空斑均能扩增出LacZ基因，证实所获得的重组病毒为伪狂犬病病毒Bartha株TK^-/LacZ^ 突变株。TCID50试验表明，TK失活对Bartha株在细胞上增殖无影响；Balb/C小鼠试验表明，该突变对Balb/C小鼠的安全性明显高于Bartha亲本毒株。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRY基因缺失疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-／gE^-／GP5^＋免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力，本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因，构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-／gE^-／GP5m^＋。经PCR、Southem Blot、Western blot证实构建正确，并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TX^-／gE^-／GP5m^＋与TK^-／gE^-／GP5^＋分别免疫Balb／c小鼠，结果TK^-／gE^-／GP5m^＋免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体（3／6只达到了1：16），而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-／gE^-／GP5^＋，表明TX^-／gE^-／GP5m^＋是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。     

伪狂犬病病毒感染诱导和抑制细胞凋亡

用伪狂犬病病毒 (pseudorabies virus,PRV)鄂 A株感染非免疫健康初生仔猪 ,5 d后出现典型的伪狂犬病临床症状。从感染 PRV鄂 A株仔猪的肾脏、肝脏、扁桃体、胸腺、腹股沟淋巴结、颈部淋巴结等组织细胞提取的 DNA,经琼脂糖凝胶电泳呈现大小不等的 180～ 2 0 0 bp整倍数的寡核苷酸片段梯状条带 ,经 PCR方法鉴定为 PRV DNA。末端脱氧核苷转移酶原位标记 [terminal deoxynucleotidyl transferase(Td T) - conjugated d UTP nick end labelling,TUNEL ]法显示 ,部分凋亡的阳性细胞呈现染色质凝聚、细胞核固缩、染色质靠核膜边聚集等形态学变化 ,说明 PRV诱导细胞凋亡是造成急性感染时组织器官广泛损伤的重要原因之一 ;而 PRV感染的大脑、小脑、嗅球及脊髓等神经系统组织中未观察到上述细胞凋亡特征 ,说明 PRV可以抑制急性感染时神经细胞发生凋亡。本试验结果显示 ,在 PRV急性感染状态下 ,病毒诱导细胞凋亡是杀伤细胞的重要途径之一 ,同时这一过程又可通过神经系统病毒基因隐性感染及潜伏期的建立而受到抑制     

应用微量中和试验进行猪伪狂犬病血清学调查

应用细胞培养微量中和试验（固定病毒稀释血清法）对来自２４个猪场共４２６份血清进行了猪伪狂犬病血清学调查,共检出阳性血清１７１份,血清阳性率达４０．１％,出现血清阳性的猪场有２０个,占所检测猪场的８３．３％,说明伪狂犬病在我省及我国流行相当严重,对其中５０份血清中的中和指数（固定血清稀释病毒法）进行了检测,结果中和效价大于１：２血清的中和指数都在１０＾２．５以上。     

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的制备及安全性与免疫性试验

用本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒鄂A经毒株接种仓鼠肾细胞（BHK－21）,制备病毒抗原液，毒价不低于10^-6TCID50/0.1ml。经一定浓度的甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化研制成油乳剂灭活油疫苗4批。本研究对该制品的安全性、免疫性进行了测定。对18g左右小白鼠接种0.3ml，初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪加倍剂量注射，均未出现不良反应，安全性良好。对母猪的繁殖性能不产生影响。后备母猪及妊娠母清中和抗体指数于免疫后21d达到316以上，间隔35d加强免疫一次后，中和抗体指数可达1000以上。断奶仔猪及初生仔猪免疫后对强毒的攻击，保护率分别为100％及90.62％。     

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。     

伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株（PRV-Ea）为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。