伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。     

抗胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的单克隆抗体的制备

分别用大肠杆菌(Escherichia coli)表达的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆与筛选,分别获得能稳定分泌ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的杂交瘤2株(4、16)、3株(14、3Fll、16G10)和2株(44、53).这7株杂交瘤细胞的染色体数分别为87(81～94)、84(81～88)、90(85～94)、87(80～94)、82(79～85)、93(88～99)和85(82～87),其腹水ELISA效价分别为100×210、100×29、100×210、100×27、100×214、100×214和100×212.间接ELISA和Westernblot分析结果证明,所有单克隆抗体均具有与相应天然毒素的反应活性,且特异性良好.     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

伪狂犬病病毒IE180基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

提取伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株基因组DNA,BamH I酶切后回收4.8kb左右的片段,克隆到pUC18中,酶切分析和部分序列测定筛选到含IE180基因的重组质粒pUCIE.进一步将长约1.8kb的IE180基因5′端部分编码区亚片段克隆到原核表达载体pET-28a中,使其置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合,重组表达质粒pET1.8转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量为62 000,同预期大小相当,并能同抗6×His的抗体发生特异性反应.     

伪狂犬病病毒鄂A株gC基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

 以伪狂犬病病毒国内地方分离株 (鄂A株 )为材料 ,采用核酸杂交、DNA重组技术直接从基因组DNA中克隆了最主要的保护性抗原基因gC ,测定了全序列并对其原核表达产物作为血清学诊断抗原进行了初步探讨。结果表明 :所克隆的 gC基因全长 175 5bp(含启动子序列和 poly(A)信号序列 ) ,具有典型I型膜蛋白结构特征。同具有代表性的国外标准株NIA 3株、IndianaS株相比 ,多个酶切点不同 ,尤其是具有分型意义的BamHI位点消失 ;氨基酸水平上也存在一定程度的差异 ,鄂A株 gC可编码 4 87个氨基酸残基 ,而以往所报道的gC均只编码 4 78或 4 79个氨基酸 ,有意义的是功能区突变较多 ,并存在连续 7个氨基酸残基的插入。同 pET 2 8a的 6xHis Tag融合的gC基因完整编码区在大肠杆菌中获得高效表达 ,融合蛋白分子量为 6 2ku ,能同伪狂犬病病毒高免血清发生特异性反应。纯化的表达产物作为ELISA和乳胶凝集诊断抗原 ,具有很高的敏感性和特异性     

伪狂犬病病毒Fa株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残基水平上也有差异。     

伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上，下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒，pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了 gD基因的可靠性和完整性，同时构建了测序质粒pSKgDSB,pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序，将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残苦水平上也有差异。     

逆转录病毒介导的PrV Ea株gD基因转基因细胞系的建立

采用逆转录病毒介导的方法,将PrV Ea株gD基因整合进PK-15细胞染色体中,建立起表达gD蛋白的细胞系PK^D。通过荧光观察,发现PK^D表达的gD分布在细胞膜上,具备原有的免疫反应性;同时,还发现gD蛋白在PK^D细胞膜上呈明显极性分布。PCR技术和间接免疫荧光染色法对PK^D进行检测的结果表明该细胞系具有良好的遗传稳定性。在相同培养条件下,PK^D细胞的生长速度及形态与正常PK-15细胞无明显差异。用脂质体介导的方法,将PrV Ea株基因组转染PK^D细胞,在转染后30h细胞发生典型病变,表明PK^D细胞对脂质体的毒害具有耐受性。TCID50测定结果显示：PK^D对PrV Ea株增殖尽管有明显的抑制作用,但PrV Ea株仍能在其上正常增殖。上述研究结果提示：所构建的细胞系PK^D可用于构建PrV Ea株gD基因缺失毒株,为PrV Ea株gD基因缺失毒株的构建提供了必备的工具。