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1.
本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中. 相似文献
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以牛血清白蛋白、(2,4-二羟基苯基)(2,6-二甲基苯基)甲酮(DDM)为原料,采用去溶剂化的方法,合成DDM-BSA复合纳米材料,通过紫外-可见光谱仪、透射电镜、激光粒度仪等对所合成的复合纳米材料进行表征。结果显示,所合成的复合纳米粒子尺寸分散均匀,平均粒径49.3nm,对DDM药物的负载率为37.4%,80h后体外释放率可达95.4%。在此基础上,评估了复合纳米粒子对MARC-145细胞的细胞毒性及对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响。结果发现,当牛血清白蛋白负载的DDM质量浓度为12μg/mL时,MARC-145细胞的存活率超过90%,该质量浓度的复合纳米粒子可有效抑制PRRSV病毒的增殖,与单纯使用DDM相比,具有更好的抗病毒效果。 相似文献
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基于西门利克森林病毒复制子的"自杀性"DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性 总被引:2,自引:0,他引:2
对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSfV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs)上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS-FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性,将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21细胞,转染后12h即可观察到荧光,但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro/Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1;提取转染后48h的细胞基因组DNA,电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder),而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明:改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作,而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡,为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。 相似文献
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对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆,构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序,结果表明:Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式,分别编码106或98个氨基酸残基,Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区,将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较,发现二者在组成和结构上存在多处保守序列,尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点,C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列,但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。 相似文献
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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应 总被引:3,自引:0,他引:3
猪伪狂犬病毒(PRV)是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRY基因缺失疫苗株TK^-/gE^-/LacZ^+为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-/gE^-/GP5^+免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因(ORF5m)代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-/gE^-/GP5m^+。经PCR、Southem Blot、Western blot证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TX^-/gE^-/GP5m^+与TK^-/gE^-/GP5^+分别免疫Balb/c小鼠,结果TK^-/gE^-/GP5m^+免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1:16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-/gE^-/GP5^+,表明TX^-/gE^-/GP5m^+是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。 相似文献
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猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定 总被引:1,自引:2,他引:1
对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株(PrV HB-98株)的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明,PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50/0.1mL以上,与亲本毒株相当,但高于Bartha株;与PrV鄂A株相比,病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB/c小鼠的死亡,毒力也低于Bartha株;将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次,各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增,未出现毒力回复现象.表明该毒株具有良好的遗传稳定性;以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50~60d母猪和1日龄仔猪,母猪均能正常产仔.仔猪也未出现任何临床症状,证明该毒株有较好的安全性。另外,以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50~60d母猪和1日龄仔猪,分别于接种后28d和20d,用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击.结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击.获得保护,表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明,PrV HB-98株可以作为候选毒株.用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。 相似文献
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UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。 相似文献
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用EcoR Ⅰ酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ 基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞.收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2 .用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证日月该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白.重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定.该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1 TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8 TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8 TCID50/0.1mL. 相似文献