伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.     

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的克隆、序列分析及表达

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21（DE3）,在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化

构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物.     

伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1 000bp片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,双脱氧末端终止法序列测定.通过OM1GA2.0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30.38 kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上.将α-疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域.将该片段插入原核表达载体pGEX-KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX-UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56 kD.     

三黄鸡CD154基因的克隆、序列分析与表达

CD154在抗原特异的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用。利用RT-PCR方法从三黄鸡的外周血单核细胞(PBMC)中克隆了鸡CD154基因全长cDNA,序列分析显示该基因cDNA全长819bp,可编码272个氨基酸。将克隆的鸡CD154全长cDNA克隆到原核表达载体pET-28a中获得表达质粒pET-28a-CD154,转化BL21(DE3)后未检测到特异性表达蛋白。进一步通过PCR获得去除信号肽(1~22 aa)和跨膜区(23~46 aa)的CD154基因片段(CD154d),并将其克隆到pQE80的6×His下游,在大肠杆菌中成功表达,获得分子量约27 ku的融合表达蛋白6×His-CD154d。Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。同时,将CD154基因全长cDNA插入真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得真核表达质粒pEGFP-CD154,转染Hela细胞,荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白表达在细胞膜上,证实了鸡CD154的膜定位特性。本研究为进一步研究鸡CD154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

伪狂犬病病毒上海株EP0基因的序列分析及其表达载体的构建

以伪狂犬病病毒上海株 (PRV SH)细胞感染物为模板 ,PCR扩增出 1 2 3kb的EP0基因完整编码区片段 ,将该基因片段克隆到pGEM T easy中 ,经过双脱氧末端终止法序列测定 ,并同国内的PRV Ea株进行同源比较 ,发现PRV SH株EP0基因存在多处突变和一处插入。进一步将该片段插入到原核表达载体 pET32a (+)的His Tag下游 ,构建了的原核表达质粒 pETEP0 ,为今后深入研究该基因的表达及其功能奠定了基础。     

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

伪狂犬病病毒闽A株糖蛋白gD基因去信号肽片段在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达

通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及免疫原性分析

应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆到质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F,将其转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。Western blot证实重组菌表达的fliC-F融合蛋白能与小鼠抗fliC和抗F蛋白两种多抗血清发生特异性反应。动物试验显示,fliC-F融合蛋白能够刺激C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体,说明原核表达系统表达的fliC-F融合蛋白具有较好的免疫原性。