鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒构建

【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)不同毒株间存在明显差异,DEV疫苗株的UL2基因在195bp后连续缺失528bp,导致第65位氨基酸后连续缺失176aa~([1])。将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入DEV UL2基因中,获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒,以研究UL2基因对DEV生物特性的影响和探讨DEV作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的DEV细胞适应株DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T载体;以UL2基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂,将CMV启动子控制的含有GFP-gpt基因表达盒克隆入DEV UL2基因中,构建含GFP基因的转移质粒载体pT-UL2-GFP-gpt;用脂质体将其与DEV细胞适应株共转染CEF细胞,待80%细胞出现病变后,冻融3次,接种到新鲜CEF细胞单层的6孔培养板中,用含5%血清、1%双抗、1%琼脂的M199培养液覆盖,在荧光显微镜下挑取单个有绿色荧光的蚀斑,再接到新的细胞上,重复蚀斑筛选、纯化表达绿色荧光蛋白的重组病毒;利用PCR、基因测序技术鉴定重组病毒;重组病毒接种CEF(moi=0.01),每12h取出1瓶接毒细胞,分别收集上清和细胞,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;重组病毒在CEF中连续传代20次,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并用PCR检测GFP的传代稳定性;重组病毒免疫4周龄SPF鸭后14d,肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),观察免疫保护情况。【结果】经双酶切鉴定,成功构建了含绿色荧光蛋白报告基因的转移质粒载体p T-UL2-GFP-gpt,将其与DEV共转染CEF细胞后8h,即可见转染细胞中有带有绿色荧光的梭形细胞,经过8轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△UL2-GFP-gpt;PCR鉴定及基因测序结果显示,GFP标记基因成功地插入到DEV基因组中,替换了DEV UL2基因的196—723位核苷酸;一步生长曲线结果显示,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在36h和72h达到峰值,为10~(6.2)TCID_(50)/0.1m L、10~(5.5)TCID_(50)/0.1m L,与亲本毒无明显差异;重组病毒在CEF中连续传代,1—5代可以稳定表达GFP基因,第6代起,开始出现少量没有荧光的细胞病变,15—20代中绝大部分细胞病变无绿色荧光,GFP在细胞连续传代过程中容易出现突变;重组病毒以10~(3.0)TCID_(50)/只免疫麻鸭,免疫后14d能完全抵抗DEV强毒株的攻击,与亲本毒免疫原性一致。【结论】成功构建了表达绿色荧光蛋白的DEV,首次证实UL2基因缺失不影响其在细胞中的复制,也不影响其免疫原性。荧光重组病毒的构建为DEV UL2基因功能、活载体疫苗研究奠定了基础。     

牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定

为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接 ELISA 方法筛选到 2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10³和1.2×10⁴。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10⁵和4.09×10⁵,且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。     

猪源大肠杆菌血清型耐药性整合子调查

分别在北京地区采集正常猪泄殖腔拭子50份,河南123份,分离到大肠杆菌150株,分离率为86.7%.菌株血清型分布广,呈地区性、多样性和可变性.北京菌株耐药率低,除对四环素为73.8%外,对其他21种药物耐药率均在16.7%以下;河南地区菌株耐药率高,对青霉素类、磺胺甲基异噁唑高达75.0%以上.北京地区菌株整合子携带率为18.6%,河南地区为75.7%.整合子携带频率与细菌耐药性相关.     

六种哺乳动物细胞系染色体制片条件优化研究

为提高胞核学检验的检查效率,采用6种具有种属代表性的常用传代细胞系对影响检验的关键步骤(染色体制片条件)进行优化,并对这六种传代细胞系的染色体数目进行了统计。实验以CHO、BHK-21、ST、OA3.Ts、MDBK、RK-13六种疫苗生产中常用的传代细胞系作为材料,对影响染色体制片效果几个主要条件(秋水仙素浓度、KCl浓度及低渗处理时间)进行了优化,并对这六种细胞染色体数目分布进行了检查。结果发现,在细胞用25 cm~2细胞培养瓶1∶2比例传代24～48 h时,秋水仙素浓度为1μg/mL,处理60 min后处在中期分裂相的细胞最多,视野中染色体长度适中;用0.4%KCl溶液低渗处理40 min,细胞中染色体在载玻片上形态最佳,分散度最好。优化后的染色体制片条件,可适用于多种细胞的染色体制片,结果重复性好,染色体形态和分散度均满足胞核学检验要求,可为胞核学检验的流程标准化制定提供有益参考。     

鸡传染性支气管炎病毒H120株和H52株种毒的制备与鉴定

鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株种毒由中国兽医药品监察所制备和供应,种毒的保存期为10年,为了保证种毒的质量和供应,需要定期制备种毒。将H120株、H52株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养,收获鸡胚尿囊液,与50 g/L牛乳蔗糖溶液等体积混匀,进行分装和冷冻真空干燥。对其进行剩余水分测定、真空度测定、病毒含量、安全性、免疫原性、纯净(无菌检验、支原体检验、外源病毒)和特异性检验,检验结果表明,各项检验均符合规定。同时为了区分H120株、H52株种毒,用实验室已建立的RT-PCR和酶切方法对2种种毒进行鉴别检验,结果表明能准确区分H120株和H52株种毒。试验结果为疫苗生产提供了能长期保存且稳定性好、高滴度的生产用种毒,也可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。     

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-5+Re-4)免疫鸡和鸭后抗体消长规律

禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病.根据致病性的不同将禽流感分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(IPAI),HPAI被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,我国将其列为一类动物疫病 [1].近几年来,禽流感在世界各地反复出现,2004年亚洲发生了高致病性禽流感,2006年底和2007年初东南亚又出现疫情,并发现了人感染禽流感.我国养禽业也一直受到禽流感的威胁.因此,它不仅给畜牧业造成了巨大的损失,而且给人们的公共卫生安全带来了严重的威胁.     

血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究

从山东某疑似感染禽腺病毒的发病鸡群中采集病料并分离到一株禽腺病毒,克隆纯化后进行PCR检测和序列分析,鉴定该毒株为血清4型禽腺病毒,命名为GY株。用LMH细胞繁殖的GY株病毒滴度可以达到107.5 TCID₅₀/0.1mL,并建立了纯净稳定的种子批。动物致病性试验结果显示,攻毒鸡只8/10死亡,剖检均出现心包积液,肝脏肿大、出血或坏死,表明该毒株为强毒株。就攻毒途径、攻毒剂量等方面研究发现,GY株经胸部肌肉注射后发病率和发病时间相对颈部皮下注射途径更有优势,确定攻毒途径为肌肉注射;通过比较不同剂量(5×10^3.0~5×10^6.0 TCID50)GY株病毒攻击SPF鸡的致病性,将攻毒剂量定为5×10^5.0 TCID₅₀。研究表明,GY株可作为禽腺病毒4型攻毒用强毒株。     

一株牛支原体的分离鉴定及致病性初步研究

对采集到的疑似牛支原体肺炎肺组织病料进行病原的分离,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定,结果显示成功分离获得1株牛支原体,命名为NM001。该分离株的菌落形态呈典型的“荷包蛋状”,不能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素。PCR能够扩增出牛支原体特异的P48基因条带,16S rRNA基因序列与Ningxia-1序列同源性为99.03%。将该分离株接种2头6月龄犊牛均出现明显的临床症状,剖检后胸腔中少量淡黄色渗出液,肺脏出现肉样实变。试验结果表明,分离到的牛支原体NM001株对牛具有较强的致病性,为牛支原体攻毒模型的建立奠定了基础。     

猪链球菌2型的鉴定及其毒力因子检测

猪链球菌的感染不仅对养猪业造成巨大的损失,同时对公共卫生尤其是相关从业人员的生命造成威胁,严重感染引起死亡.根据参考文献,设计了1对猪链球菌2型特异性引物.对四川分离的7株链球菌、江苏分离的1株、北京分离的6株和菌种中心保存的5株C群马链球菌兽疫亚种、1株D群链球菌、4株R型链球菌、2株S群链球菌和E、F、G、K、L、M、N、O、P群链球菌各1株进行了检测.结果7株四川分离株均为2型;1株江苏分离株为2型;6株北京分离株有3株为2型;1株R群、2株s群链球菌为2型猪链球菌.对检测出的14株猪链球菌2型的毒力因子做进一步检测.MRP基因检出率为92.9%(13/14);EF基因检出率为100%(14/14);sly基因检出率为71.4%(10/14);Cps2A基因检出率为92.9%(13/14);gapdh基因检出率为64.3%(9/14);FBPS基因检出率为92.9%(13/14);orf2基因检出率为71.4%(10/14).毒力因子全为阳性的菌株有6株,MRP-EF+菌株有2株.本研究从259份健康猪扁桃体中分离到16株2型猪链球菌,健康猪带菌率为6.2%(16/259).16株猪链球菌2型中,MRP、EF、Cps2A全为阴性,只从1株2型猪链球菌中检测到了sly基因(1/16);gapdh基因检出率为56.25%(9/16);FBPS基因检出率为75.0%(12/16);Orf2基因检出率为37.5%(6/16).