猪白细胞介素2／6嵌合基因的融合表达及活性

采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。     

猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达.通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化.采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性.结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因.嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上.rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104 IU·mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U·mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应.这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础.     

长白猪肿瘤坏死因子α成熟肽基因克隆、表达及其表达产物活性检测

本研究旨在克隆和表达猪肿瘤坏死因子成熟肽基因及其表达蛋白的生物活性。根据GenBank登录的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)成熟肽基因序列设计一对上下游引物。应用RT-PCR技术直接从丹系长白猪脾脏组织中扩增猪的TNF-α成熟肽基因。将RT-PCR扩增到的特异性片段克隆到pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-TNF重组质粒,经宝生物(大连)有限公司测序,该TNF-α成熟肽基因的长度为465 bp,编码154 aa。以重组克隆质粒pGEM-TNF为模板,PCR扩增猪TNF-α成熟肽基因,并将其插入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明表达的融合蛋白约为38 ku,重组蛋白以包涵体形式表达,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的36.8%。细胞毒T细胞试验表明所表达的蛋白经初步纯化、变性复性后,可明显增强淋巴毒性T细胞作用。结果提示长白猪肿瘤坏死因子得到了成功克隆与表达,表达的蛋白产物具有一定的生物活性。     

猪IL-22的原核表达及其活性研究

为表达猪白细胞介素22(PoIL-22)并研究其活性,本研究从猪小肠上皮细胞IPEC-J2中扩增出568 bp的PoIL-22编码序列,并以其为模板进一步扩增去除信号肽的PoIL-22 471 bp序列。将该去信号肽基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达了重组蛋白PoIL-22(rPoIL-22),经过Ni-NTA亲和层析纯化。此外,以纯化的rPoIL-22刺激IPEC-J2后,能够上调IPEC-J2表达猪beta防御素2,并表现剂量依赖效应。由此证明本实验中表达的rPoIL-22具有生物学活性。rPoIL-22的制备为进一步研究其在猪粘膜免疫中的作用奠定了基础。     

猪白细胞介素-2在BHK-21细胞中表达及其活性分析

为鉴定BHK-21细胞中稳定表达猪白细胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技术从猪的淋巴细胞中克隆PoIL-2基因,将其连接于pcDNA3.1载体中,并转染BHK-21细胞.经过G418筛选及RT-PCR鉴定,获得稳定表达PoIL-2基因的BHK-21细胞系.采用实时定量PCR及ELISA测定PoIL-2在BHK-21细胞内的表达,同时以淋巴细胞增殖试验(MTT)检测PoIL-2蛋白活性.试验结果表明稳定整合PoIL-2基因的BHK-21细胞系其PoIL-2 mRNA的转录效率是阴性对照组1.43倍,蛋白表达量是阴性对照组1.29倍.MTT试验表明真核表达的PoIL-2促淋巴细胞增殖活性与阴性对照组相比差异极显著(p＜0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIL-2具有良好的生物学活性.本研究为开发新型基因工程疫苗佐剂和抗病毒制剂奠定了基础.     

猪α干扰素的原核表达及抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究采用PCR技术自猪肝脏总DNA中扩增、克隆猪α干扰素（PoIFN-α）成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素（rPoIFN-α）蛋白通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒（VSV）增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的增殖活性,以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度。结果表明,克隆的PoIFN-α成熟肽基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白纯度在95%以上;纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×10^4IU/mL（5.2×10^6IU/mg）,在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效剂量为640U/mL（2.3×10^4U/mg）。这些研究结果为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于高致病性PRRSV性疾病的预防和治疗奠定了基础。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

猪IL-2与IL-6的融合表达及活性研究

为获得具有猪白细胞介素-2(pIL-2)和猪白细胞介素-6(pIL-6)双重活性的融合蛋白,研究其作为高效免疫佐剂的可行性,本研究利用基因重组技术将克隆到的pIL-2和pIL-6的成熟肽基因利用一段柔性Linker序列串联后插入到原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌,42℃诱导表达得到融合蛋白pIL-6-2,对蛋白进行纯化复性后用MTT法检测其生物学活性。结果显示不同浓度pIL-6-2蛋白对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性差异很大,0.1μg/mL浓度的pIL-6-2活性最好。本研究为利用该蛋白作为高效免疫制剂的应用奠定了良好基础。     

抗猪瘟病毒单链抗体的原核表达及活性鉴定

为了制备抗猪瘟病毒(CSFV)单链抗体(scFv)并鉴定其生物学活性,试验以编码特异性抗CSFV scFv基因序列为基础,按照大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成scFv基因,将其克隆入pCzn1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行Ni-IDA亲和层析纯化、SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)和间接ELISA验证蛋白抗原的活性。结果表明:密码子优化合成的抗CSFV scFv基因全长768 bp,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,其分子质量约28.0 ku,Western-blot检测显示纯化后的目的蛋白能被抗His标签单克隆抗体特异性识别,IFA和ELISA检测证实纯化复性后的蛋白可与CSFV发生特异性结合反应,且存在明显的浓度依赖性。说明应用原核表达系统可高效制备抗CSFV scFv。     

猪白介素4在CHO-K1细胞中的重组表达及生物学活性分析

将猪白介素4(Porcine interleukin4,PIL-4)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pEGFP-PIL-4,利用脂质体法转染CHO-K1细胞,采用荧光显微镜实时观察、RT-PCR和Western-blot分别检测CHO细胞转录表达目的分子的情况,通过MTT法检测所表达蛋白的生物学活性。结果在将重组质粒转染CHO-K1细胞中24、48 h后的均观察到绿色荧光;经G418筛选14~20 d后转染的细胞形成了阳性细胞集落,用RT-PCR扩增出约339 bp的目的基因片段;经Western-blot检测到约为39 000的特异蛋白分子条带,并证明在转染重组质粒的细胞中表达了高生物活性的重组蛋白。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础.     

荣昌猪白细胞介素15成熟肽基因的克隆、表达及其表达产物活性检测

运用RT—PCR技术从由刀豆蛋白（ConA）诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞（PBMC）扩增出猪白细胞介素15（pIL-15）完整开放阅读框（ORF），共489bp，编码162aa。与已公布的2个猪IL-15基因核苷酸同源性均为99．4％。分子进化分析表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与鸡的IL-15基因进化距离较远。运用PCR技术从含荣昌猪IL-15开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因，共345bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a（＋）后在E．coli BL21中诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为34ku，重组蛋白以包涵体形式表达，表达产物约占菌体总蛋白的38．7％；Western blot分析表明，在相对分子质量34ku处有一条特异性带；对诱导重组菌进行转录检测得到约356bp的特异性片段。MTT法试验证实，表达产物初步纯化、透析复性后，可明显增强淋巴细胞的增殖。荣昌猪IL-15成熟肽成功在体外表达，获得的高效表达的产物具有一定的生物学活性。     

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。