猪传染性胃肠炎病毒四川株M蛋白基因克隆分析及真核表达载体构建

猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transm issible Gas-troenteritis virus,TGEV)主要引起2周龄以内仔猪发生以严重急性腹泻、脱水及高死亡率为特征的猪传染性胃肠炎(TGE)。研究从猪传染性胃肠炎病毒四川株(SC-Y)中扩增克隆获得M蛋白基因,并成功构建了其真核表达载体,这为进一步深入     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白 ORF1的克隆及结构特征分析

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白的ORF1序列,将其进行克隆、序列测定和分析。确认SC-Y株ORF1全长20 053 nt(GenBank收录号DQ390461)。该序列包含2个ORF,其中ORF1a由12 053个核苷酸构成,可编码由4 018个氨基酸组成的多肽,ORF1b由8 036个核苷酸构成,可编码由2 678个氨基酸组成的多肽。对SC-Y与TGEV参考毒株及不同冠状病毒对应区进行序列比较,结果显示,SC-Y株与PUR46-MAD株的同源性最高,ORF1a的核苷酸同源性为99.5%,推导氨基酸同源性为99.2%,ORF1b的核苷酸及推导氨基酸同源性均为99.8%;不同冠状病毒之间ORF1b比ORF1a具有更高的保守性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

荣昌猪白细胞介素15成熟肽基因的克隆、表达及其表达产物活性检测

运用RT—PCR技术从由刀豆蛋白（ConA）诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞（PBMC）扩增出猪白细胞介素15（pIL-15）完整开放阅读框（ORF），共489bp，编码162aa。与已公布的2个猪IL-15基因核苷酸同源性均为99．4％。分子进化分析表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与鸡的IL-15基因进化距离较远。运用PCR技术从含荣昌猪IL-15开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因，共345bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a（＋）后在E．coli BL21中诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为34ku，重组蛋白以包涵体形式表达，表达产物约占菌体总蛋白的38．7％；Western blot分析表明，在相对分子质量34ku处有一条特异性带；对诱导重组菌进行转录检测得到约356bp的特异性片段。MTT法试验证实，表达产物初步纯化、透析复性后，可明显增强淋巴细胞的增殖。荣昌猪IL-15成熟肽成功在体外表达，获得的高效表达的产物具有一定的生物学活性。     

猪白细胞介素-15基因的克隆及生物信息学分析

参照GenBank登录的猪白细胞介素-15(IL-15)基因序列自行设计1对特异性引物，运用RT PCR技术从由刀豆蛋白A(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞扩增出猪IL-15基因的完整CDS序列，全长489 bp。同源比对结果表明，荣昌猪IL-15基因与已公布的2个猪种IL-15基因核苷酸同源性均为99.4%,与哺乳动物的同源性较高，与鸡的同源性较低。密码子偏爱性分析显示，荣昌猪IL-15基因在密码子使用上存在一定的偏爱性；分子进化分析结果表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与禽类鸡的IL-15基因进化距离较远；结构域预测分析显示其与人的IL-15存在很大的相似性，可能在功能上有相似性。