猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORFl和ORF2基因的克隆与表达

猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用

为制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。     

猪圆环病毒2型(PCV2) Cap基因原核表达及抗血清制备

Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28 000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap.本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定.将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白.根据文献报道,致病性的PCV-2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX-6p-1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段.通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE结果,重组质粒pPRO-Cap和pPRO-Rep以及pGEX-△Cap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%.将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV-2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX-△Cap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV-2感染用候选抗原.     

PCV3河南株Cap基因的克隆、测序及其在大肠杆菌中的表达

为研究猪圆环病毒3型(PCV3)Cap基因在大肠杆菌中的表达产物是否具有免疫原性,根据GenBank中发表的PCV3基因组序列,设计1对特异性引物,PCR扩增PCV3 Cap基因,克隆到pMD18-T载体。测序结果表明获得了Cap基因,其大小为543bp。并将Cap亚克隆到原核表达载体pET-28a中,再转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,获得重组菌株。获得的重组菌37℃、0.6mmol/L IPTG诱导6h,进行SDS-PAGE及Western blot分析。重组菌破碎后从沉淀中获取1条约24 600的新蛋白带,可与小鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应。有研究表明PCV3与PCV2不具有免疫交叉保护作用,因此本试验表达的具有良好的抗原性PCV3 Cap蛋白,为PCV3新型亚单位疫苗和ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础.     

猪圆环病毒2a型和2b型Cap蛋白的原核表达及鉴定

为制备猪圆环病毒2a型（PCV2a）和2b型（PCV2b）Cap蛋白，用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至p ET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株，通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达，采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示：重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 k Da，在不同温度下都以包涵体形式存在，在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白，为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因的克隆与原核表达

为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性.     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

V5标记的猪圆环病毒2型Cap蛋白重组杆状病毒表达载体的构建

试验旨在利用真核表达系统构建V5标记的猪圆环病毒2型（PCV2） Cap蛋白的表达载体。采用基因工程技术将V5标签引入到PCV2 ORF2基因C末端,并将标记基因定向克隆入pFastBacHTA载体,将pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使用脂质体介导法将鉴定后的重组杆状病毒质粒转染于Sf9细胞中;运用间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE和Western blotting试验对Sf9细胞中V5标记Cap蛋白的表达进行验证。结果显示,本试验成功将V5标签引入到PCV2 ORF2基因末端,pFastBacHTA-ORF2-V5重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后获得了Bacmid-ORF2-V5重组杆状病毒质粒;IFA、SDS-PAGE和Western blotting试验结果显示,在Sf9细胞中能检测到重组杆状病毒V5标记的PCV2 Cap蛋白,具有良好的反应原性,说明本试验成功获得一株rAcMNPV Cap-V5重组杆状病毒。试验结果为PCV2标记亚单位疫苗的研制提供一定的理论依据。     

Preparation of Polyclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2b Cap Protein and Analysis of its Biological Characteristics

In order to build more effective use of porcine circovirus type 2b (PCV2b) Cap protein on the diagnosis and control of diseases like porcine circovirus disease, the ORF2 gene which encoding porcine circovirus type 2b Cap protein was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a (+), constructing a recombinant plasmid pET-32a-ORF2, then the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG to express recombinant protein, the recombinant protein was purified with nickel column.Then polyclonal antibody (PcAb) was prepared by immunization of rabbit with purified protein.ELISA, Western blotting, indirect immunofluorescence assay and the specificity experiments were used to detect the biological characteristics of the polyclonal antibody.The titer of polyclonal antibody was about 1:2¹⁶ detected by ELISA.Western blotting result confirmed that polyclonal antibody could react with PCV2b specially.Indirect immunofluorescence assay showed that polyclonal antibody was able to detect PCV2b in PK-15 cells, this result suggested that the polyclonal antibody had the ability to differential diagnosis of PCV2b.The specificity experiment showed that the polyclonal antibody only reacted with PCV2b, and did not react with PEDV, TGEV, PRRSV, PRoV, PRV and PPV.The polyclonal antibody against PCV2b prepared in this study provided a powerful tool for the study of etiological characteristics and clinic diagnosis of this disease.     

猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap羧基端多肽原核表达及抗原性分析

本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。