猪源和犬源ELF4蛋白的亚细胞定位比较研究

本研究旨在对比分析猪E74样因子4(sELF4)和犬E74样因子4(cELF4)的亚细胞定位,为深入开展二者功能研究提供依据。利用PCR截短扩增sELF4和cELF4,分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,构建17个sELF4重组真核表达载体和13个cELF4重组真核表达质粒,转染HeLa细胞、Hoechst33342染色,荧光倒置显微镜观察亚细胞定位,运用生物信息学软件分析其编码氨基酸序列特征。结果表明,sELF4和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,sELF4 196～291 aa(586～873 bp)之间有可能存在两个细胞质核定位信号肽,cELF4的核定位信号肽分布在203～291 aa(607～873 bp),cELF4 292～663 aa(874～1 992 bp)、sELF4 292～662 aa(874～1 989 bp)在细胞中发生聚集现象。cELF4与sELF4氨基酸序列在第169～303位氨基酸之间均高度保守,其他区段均存在不同程度的差异。综上,sELF4蛋白全长和cELF4蛋白全长均定位在细胞核中,截短表达的羧基端功能区有聚集现象,二者的核定位信号肽分布有...     

犬ELF4基因原核表达及其卵黄抗体的制备

【目的】克隆犬转录因子ELF4基因（cELF4）,体外表达重组cELF4蛋白（rcELF4）并制备抗该蛋白的卵黄抗体（IgY）,为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料。【方法】采用RT-PCR扩增cELF4基因,将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征。将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET28a-cELF4,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂（ISA 15AVG、 ISA 71VG、 ISA 201VG）乳化制备免疫原,通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量。构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4,转染细胞后,利用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）分析cELF4特异性IgY的免疫活性。【结果】cELF4基因（GenBank登录号MZ198105）的开放阅读框（ORF）为1992 bp,编码663个氨基酸残基。cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高 （99.3%）,而与小鼠的相似性最低 （81.5%）。结合系统进化结果发现, cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近,而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远。rcELF4蛋白分子量大小约100 kD,可刺激鸡产生相应抗体, ISA 15AVG、 ISA 71VG和ISA201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值,其中ISA 201VG组效价最高 （>128000倍）,且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳,首免后35 d达峰值,其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高,为256000倍。3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液,与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应。rcELF4蛋白定位在细胞核。【结论】 rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达,且存在翻译后修饰现象,不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响,所制备rcELF4抗体免疫活性良好,且与人ELF4蛋白存在交叉反应。     

猪圆环病毒2a型和2b型Cap蛋白的原核表达及鉴定

为制备猪圆环病毒2a型（PCV2a）和2b型（PCV2b）Cap蛋白，用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至p ET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株，通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达，采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示：重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 k Da，在不同温度下都以包涵体形式存在，在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白，为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。