鸡源志贺菌16SrRNA基因克隆、测序及同源性分析

目的:建立鸡源志贺菌的16SrDNA序列分析方法从而进一步从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌。方法:用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌16SrRNA的部分基因(16SrDNA)并测序,将所获得的序列与GenBank中人志贺菌序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。结果:首次研究发现鸡源志贺菌的16SrDNA序列与已知的人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99·7%,与人福氏志贺菌的同源性为96·0%。结论:16SrDNA序列分析鉴定志贺菌是一种快速、可靠的方法。     

袋鼠摩根氏菌生物特性鉴定及系统发育分析

本研究利用Biolog快速鉴定系统、16S rRNA序列分析及传统细菌鉴定方法对3株分离自北京动物园袋鼠肺脏的菌株进行形态学、培养特性、生化特性、小鼠致病性等生物特性的鉴定及系统发育分析。结果表明,3株菌株均为摩根氏菌,对昆明小鼠有强致病性;3株袋鼠摩根氏菌16S rRNA序列与LMG7874模式株同源性均为99.8%,且位于系统发育树的同一分支。     

3株斑羚、岩羊化脓隐秘杆菌的鉴定及系统发育分析

本研究利用Biolog快速鉴定系统、16S rRNA序列分析及传统细菌鉴定方法对3株分离自北京动物园斑羚、岩羊化脓隐秘杆菌进行了鉴定和系统发育分析。结果表明,3株菌株均为化脓隐秘杆菌;系统发育分析结果表明,3株化脓隐秘杆菌16S rRNA序列与NCTC5224模式株同源性均为100%,且位于系统发育树的同一分支。     

鸡源鲍氏志贺菌hn03株的分子鉴定与演化分析

以鸡源鲍氏志贺菌为研究对象,根据GenBank中收录的相应序列针对8个看家基因thrB/thrC、trpC/tr-pB、purM/purN、mdh/argR设计相应引物,分别扩增出8个目的基因,然后克隆到pMD18-T vector,进一步测定序列,并将序列测定结果登陆GenBank。利用BLAST和ClustalX程序分析测序结果,构建了8个看家基因在染色体上4个区域的相应遗传进化树。由构建的系统进化树可知：志贺菌分为3个主要分支,且均落在大肠杆菌中,本研究中的分离菌株鸡源鲍氏志贺菌在染色体上4个区域的进化树中分布位置一致,均落在志贺菌3个主要分支中的第一分支;从整个基因水平上看,鸡源鲍氏志贺分离株应起源于人源志贺菌。     

牦牛源鲍氏志贺菌的鉴定及对BALB/c小鼠的致病性

本试验旨在对从待屠宰健康牦牛中分离的志贺菌进行鉴定及确定分离株的致病性.通过形态染色、培养特性、生化特性、血清型鉴定、16S rRNA基因序列分析以及BALB/c小鼠的LD50测定等方面对分离株进行系统鉴定,并对分离株进行电镜观察和药敏试验.结果显示,分离株形态染色、培养和生化特性符合志贺菌的特点,血清型鉴定为鲍氏6型志贺菌,16S rRNA基因序列系统演化分析表明,分离菌株与人源鲍氏志贺菌和宋内志贺菌亲缘关系近,而与其他动物志贺菌亲缘关系较远,分离株对BALB/c小鼠具有致病性,其LD50值为2.5×107.5 CFU,药敏试验结果显示分离菌株对常用抗生素无耐药性.本次试验首次从健康牦牛中分离的鲍氏6型志贺菌具有较强的致病性,与人源菌株亲缘关系较近,提示牦牛中分离的鲍氏志贺菌具有公共卫生学意义.     

鸡约氏乳杆菌的分离鉴定及进化分析

从3日龄健康小鸡肠道中分离到1株乳杆菌,用PCR方法从分离菌株扩增16S rRNA基因,获得大小为1340 bp的DNA片段,该片段的核酸序列已提交GenBank,登录号为EU290749。将分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上其它乳杆菌进行同源性分析并建立进化树。结果表明,分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与NCBI公布的鼠约氏乳杆菌分离株(AB295648)的同源性为99.6%,因此该分离菌株被鉴定为鸡约氏乳杆菌(chicken Lactobacillus johnsonii),命名为HN/0711。     

羊源性D型产气荚膜梭菌的分离及PCR鉴定

对青海省互助县送检的2份病死羊组织,经细菌学厌氧分离培养,参考已发表的产气荚膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)合成引物,采用PCR和多重PCR扩增目的基因条带,并对分离株细菌的16S rRNA基因序列进行了同源性及系统发育分析。结果显示:从其中1份病死羊组织中分离获得1株β溶血型革兰阳性杆菌,经PCR和多重PCR扩增可得16S rRNA基因和α、ε毒素基因的目的条带;分离株细菌的16S rRNA基因序列与GenBank上已登录(登录号:NR113204.1、NR121697.2)的产气荚膜梭菌的相应序列具有高度同源性(≥99.0%),同KU714939.1的遗传关系最为亲密,因此经分子生物学方法鉴定分离株细菌为D型产气荚膜梭菌。     

一株致仔猪关节炎粪肠球菌的鉴定

对1株分离自关节炎病仔猪的肠球菌进行鉴定。选用常规方法进行染色特性、培养特性观察以及药物敏感性和致病试验,然后利用Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定,并用PCR方法扩增分离株的16 S rRNA基因,克隆并测序,与GenBank上登录的相关菌株及3个粪肠球菌标准菌株进行16 SrRNA序列比较、同源性分析并构建系统发育树。结果显示,该分离株形态及染色特性与肠球菌一致,对仔猪具有一定的致病性,并对临床常用的7种药物产生了耐受性;Vitek-32生化鉴定和16 S rRNA基因同源性分析及比对结果均显示其为粪肠球菌(E.faecalis)。试验证实了粪肠球菌可导致仔猪关节炎。     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

一株猪源棒状杆菌的分离及其16S rRNA基因分析鉴定

四川某商品猪场仔猪出现以体温升高,背、腹和腿部皮肤发绀,淋巴结出血肿大,肺、脾脏出血、化脓为主要特征的疾病。通过对分离细菌的纯化培养、形态学观察、生化试验、致病性试验和药物敏感性试验,鉴定出一株致病菌。应用通用引物对其16S rRNA基因进行克隆和序列分析,序列在NCBI上进行BLAST比对,选择同源性较高的棒状杆菌属中25株不同种的菌株16S rRNA序列进行比对分析,构建遗传进化树。分离纯化的细菌在鲜血琼脂平板厌氧条件下生长良好,为革兰氏染色阳性杆状菌,能发酵部分糖类,能致死小白鼠,对头孢类抗生素敏感,16S rRNA序列与棒状杆菌属细菌的同源性最高,在78.2%~98.0%之间,遗传进化树分析结果表明,该菌株与棒状杆菌属细菌属于同一分类群,分离菌鉴定为棒状杆菌。     

鸡和人志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药的关系

通过药敏实验检测了鸡鲍氏、人鲍氏和人福氏三株志贺菌对12种常用抗生素的耐药情况,发现三者均未产生对喹诺酮类药物的耐药性。用聚合酶链反应(PCR)分别扩增三株志贺菌的DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因,并对其中的耐喹诺酮类决定区(QRDR)进行了分析。发现鸡和人鲍氏志贺菌QRDR区的序列没有发生任何碱基突变,这与药敏试验结果相吻合。人福氏志贺菌虽然也对喹诺酮类无耐药性,但其gyrA基因存在83位Ser83(TCG)→Leu(TTG)的突变,由于只有83位点一处突变,所以尚未表现出耐药性表征,parC基因中存在58位Ser58(AGC)→Ile(ATC)的突变,该突变点与常见的80、84位氯基酸的改变有所不同,却仍在QRDR区域之中,虽然暂时还无法根据这一结果判断该突变与喹诺酮类耐药性之间的关系,但至少表明该菌株正处在耐药性演变进程之中,其在志贺菌耐药性中的确切作用还有待进一步研究。     

禽大肠杆菌的分离与16S rRNA的鉴定

从疑似患有大肠杆菌病的病死鸡群中采取粪便样品,分离病原进行生化鉴定,从8份样品中分离鉴定出6株大肠杆菌。根据细菌16S rRNA 基因的高度保守性,设计合成大肠杆菌的共同引物,对随机选取的1株细菌进行PCR扩增,并与GenBank中的E.coli 16S rRNA进行序列比对,确定这株细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌提供了一种简单、容易操作的手段。     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

一株致病性粪肠球菌的分离与鉴定

从1羽发病雏鸡中分离到1株溶血性革兰氏阳性球菌。初步分离鉴定后经攻毒试验能够造成小白鼠和雏鸡死亡,具有致病性。药敏试验表明,该菌对多种药物均表现耐药性,仅对庆大霉素、青霉素、氧氟沙星敏感。通过BLAST软件分析该菌株的16S rRNA序列,确定该致病性细菌为粪肠球菌。     

鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖及O抗原多糖的提纯与鉴定

为获得高纯度的鸡鲍氏3型志贺菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及其亚单位O抗原多糖(O-polysaccharide,O-PS),采用改良热酚水法提取鸡鲍氏3型志贺菌的LPS,并联合使用葡聚糖凝胶层析得到高纯度的LPS;采用酸水解法联合葡聚糖凝胶层析获得高纯度的O-PS。生化方法检测结果显示所提纯LPS和O-PS纯度高,兔回肠襻试验结果显示所提纯的LPS活性好。本试验结果表明提取的LPS和O-PS可进行特异性研究及制备有效的候选疫苗。     

J亚群禽白血病病毒安徽分离株的鉴定及其gp85基因序列分析

从安徽省的黄羽肉鸡和罗曼蛋鸡中各分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,克隆获得了2条相应的gp85基因序列,并与参考毒株进行序列比对。结果表明,两分离毒株与J亚群参考毒株同源性为82.1%~99.4%,分离毒株之间同源性为85.4%。其中肉鸡分离毒株与J亚群原型毒株HPRS-103同源性为97.1%,与J亚群国内毒株SD09TA04、SDYC02J同源性均为99.4%;蛋鸡分离毒株与HPRS-103的同源性为89.0%,与SD09TA04和SDYC02J同源性仅为88.6%。两分离毒株的gp85氨基酸序列出现突变和缺失,在高变区hr1、hr2变异明显。进化分析进一步表明,2个分离毒株亲缘关系较远,可能来源于不同的原始病毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒     

一例雏鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及其16SrRNA基因序列分析

为对死亡雏鸡进行病因诊断,通过大体剖检、细菌分离、生化鉴定,证实为铜绿假单胞菌感染。测定了该分离株的16SrRNA基因序列,并与GenBank中收录的序列比较,结果发现所分离的铜绿假单胞茵及参考株的16SrDNA基因序列极其保守,相似性达99％～100％;与大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的相似性差异约为9％;与鸭疫里默氏...     

河南及山西省21株鸡杆菌分离株16SrRNA基因序列分析

对21株分离自河南及山西地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列进行研究,以此分析分离株的进化关系并确定其在鸡杆菌属中所属的具体种。采用PCR方法扩增其16SrRNA基因序列,然后克隆测序。用DNAStar软件对21个菌株的序列及GenBank中已公布的鸡杆菌属相关菌株序列进行同源性比较,结果发现21株分离株之间的核苷酸序列同源性为96．0oA～100％,同鸭源鸡杆菌F279（Gallibacteriuman atis F279）（AF228002）的同源性为95．3％～99．3％,同输卵管炎鸡杆菌F150（Gallibacterium salpingitidis F150）（EU424000）的同源性为88．3％～91．5％,同虎皮鹦鹉鸡杆菌F450（GallibacteriummelopsittaciF450）（EU339196）的同源性为90．3％～93．3％,同海藻糖发酵鸡杆菌52-S3-90（Gallibacteriumtrehalosi fermentans52-s3—90）（EU339199）的同源性为88．2％～91．4％,同多杀性巴氏杆菌CCUG179（P．multocida CCUG17977）（AF294411）的同源性为85．5％～88．8％,对21株细菌的序列同以上菌株的16SrRNA基因序列进行遗传进化树分析,显示21株细菌同鸭源鸡杆菌F279（AF228002）构成一个单独的大分支。结果表明,所有分离株均属于鸭源鸡杆菌,首次大量报道了来源于河南、山西省不同地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列,为鸡杆菌分类的研究提供了参考。     

1株鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的] 阐明青海省大通县某鸡场病鸡发病原因,为奇异变形杆菌病防控提供参考。[方法] 无菌采集病鸡肝脏、脾脏和泄殖腔拭子等样品,接种普通琼脂和SS琼脂平板进行细菌分离纯化培养,挑取平板上生长的疑似菌落进行革兰染色镜检,再将分离的菌落接种生化鉴定管进行生化鉴定,同时通过PCR扩增16S rDNA和tuf特异性基因并测序。将分离菌接种雏鸡进行致病性试验,采用K-B法评价分离菌对27种抗菌药物的敏感性。[结果] 分离菌为短杆、长杆状多形性杆菌,生化特性与奇异变形杆菌相符。PCR成功扩增出1 400 bp的16S rDNA,序列比对显示与奇异变形杆菌同源性最高,为99.9%。雏鸡致病性试验结果表明,该株奇异变形杆菌对雏鸡有致病性。药敏试验结果显示,该菌株对哌拉西林、头孢吡肟和头孢噻肟等高度敏感,对环丙沙星、奥格门汀中度敏感,对氨苄西林、阿莫西林和头孢唑啉有耐药性,提示该菌对头孢类药物高度敏感。[结论] 分离到的一株奇异变形杆菌对鸡具有较强的致病性,且对多种药物表现出耐药性。