几株桑天牛成虫肠道优势细菌的分离与鉴定

为了研究桑天牛成虫肠道微生态环境,探索破坏桑天牛营养利用等功能的生物防治新途径,对健康桑天牛成虫肠道的优势细菌进行分离鉴定。选择平皿上出现3个以上的菌落作为肠道优势细菌进行分离纯化,共获得6个菌株。6个菌株均呈杆状,革兰染色和氧化酶反应均呈阴性,在25～35℃、pH 5.5～9.5的环境中生长良好,但各菌株的菌落形态及多种生化性状有差异。通过菌体形态观察、染色反应、生理生化特征分析及16S rDNA碱基序列测定与同源性分析,鉴定1、2、3号菌株分别为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),4、5、6号菌株分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)。     

羊源长角血蜱吸血后中肠优势菌群分析

本研究采用PCR-DGGE技术分析长角血蜱的中肠菌群结构。无菌条件下采集长角血蜱中肠内容物,以细菌基因组DNA提取试剂盒提取内容物细菌总DNA,以通用引物扩增制备16S r DNA V3区,DGGE电泳分离后,切胶回收、测定序列。结果表明,长角血蜱饱血雌成蜱中肠优势菌为泛菌属、柯克斯氏体属、肠杆菌属、绿脓杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属,但半饱血雌成蜱和雄成蜱中肠未检测到柯克斯氏体属(Coxiella)。     

黑广肩步甲(Calosoma maximociczi)成虫肠道细菌的分离及产脂肪酶菌株的筛选与鉴定

以柞蚕害虫黑广肩步甲(Calosoma maximociczi Morawitz)的成虫为材料,分离其肠道细菌并从中筛选产脂肪酶的菌株,了解害虫肠道细菌菌群结构,寻找具有应用价值的高产脂肪酶的微生物资源。从黑广肩步甲成虫的肠道中共分离出21个好氧细菌分离株,进一步利用选择性培养基筛选产脂肪酶的菌株并检测酶活力,获得4株产脂肪酶的优势菌株。经过生理生化特性测试和16S r DNA序列分析,确定4株产脂肪酶的菌株分别属于变形杆菌属(Proteus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。研究结果表明,黑广肩步甲成虫肠道内的细菌种类丰富,分离的4株产脂肪酶菌株的产酶活力较高,可进一步研究评价其利用价值。     

高海拔地区圈养成年大熊猫冬季粪便可培养细菌鉴定——以云南野生动物园为例

为了研究云南野生动物园圈养大熊猫冬季肠道微生物菌群结构,试验利用传统方法和现代分子生物学手段(16S rDNA分析)对其冬季粪便进行可培养细菌的分离、纯化和鉴定。结果表明:对冬季粪样通过传统方法分离鉴定的细菌种属有埃希氏菌属(Escherichia Castellani and Chalmers)、志贺氏菌属(Shigella Castellani);通过16S rDNA分析,鉴定的菌群归属于鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏志贺菌(Shigella flexner)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。在高海拔地区的环境条件下,大熊猫的肠道优势菌群为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏志贺菌(Shigella flexner)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)。     

三株优良促生菌的16S rDNA序列初探

百脉根根际分离出根瘤菌2株(LC15、LC20)与白三叶根际中分离出根瘤菌RW183基因组DNA经PCR扩增16S rDNA序列、阳性克隆检测、质粒提取测序,并与GenBank中已知序列比对,结果表明,菌株LC15与LC20的16S rDNA序列与多株克雷氏菌属(Klebsiella sp.)的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超过99.00%,RW18与勒克氏菌属中的Leclercia adecarboxylata (HQ242722)核苷酸序列同源性为99.79%,结合各菌株的主要生理生化特征,将菌株LC15与LC20初步鉴定为Klebsiella sp.,将菌株RW18鉴定为Leclercia sp.。     

桑天牛卵啮小蜂孤雌生殖及体内沃尔巴克氏体(Wolbachia)的检测

桑天牛卵啮小蜂(Aprostocetus prolixus)有孤雌生殖现象,其后代几乎为雄性。沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的一类共生菌,参与多种调控寄主的生殖活动机制。通过对外膜蛋白基因(wsp)、细菌细胞分裂蛋白基因(ftsZ)和核糖体16S rDNA基因的特异性扩增,在米蛾(Corcyra cephalonica Stainton)的DNA中分别扩增出约600、1000和900 bp的片断,验证了米蛾体内已感染了Wolbachia;而在桑天牛卵啮小蜂的DNA中未扩增出任何片断,表明Wolbachia在桑天牛卵啮小蜂体内未被感染或感染率极低。     

应用扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析技术研究竹鼠盲肠细菌菌群的多样性

本试验应用扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析(ARDRA)技术研究竹鼠盲肠细菌菌群的多样性。利用免培养的分子生物学技术,从竹鼠盲肠内容物中提取细菌的总DNA,用细菌通用引物F27/R1492扩增出细菌16S rDNA的基因,构建16S rDNA基因文库。采用HaeⅢ和HhaⅠ2种限制性内切酶对阳性克隆子的扩增产物进行酶切,挑选不同的操作分类单元(OTU)测序,通过Blast在线比对,分析竹鼠盲肠细菌菌群的多样性。结果表明:竹鼠盲肠中的细菌菌群大部分是未培养或未知的菌株,在分类学上具有潜在意义的被选菌株,而且存在可能和脂肪代谢有关的微生物群体。同时也有乳酸菌属、芽孢杆菌属、梭形杆菌属和多黏类芽孢杆菌属的分布。从结果中看出,芽孢杆菌属、梭形杆菌属和2个未知菌株的克隆数都大于20个,是优势菌株。     

褐黄血蜱中肠内容物菌群结构分析

为了解褐黄血蜱的带菌情况及其公共卫生意义,本研究在无菌条件下采集褐黄血蜱中肠内容物,提取细菌总DNA为模板,采用通用引物PCR扩增细菌16S r DNA V3区,经DGGE电泳回收DGGE 16个优势条带,并选取其中13个条带进行测序分析,结果显示,选取条带分别与立克次氏体属、柯克斯氏体属、假单胞菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌属等高度相似。采用传统细菌学方法,从中肠内容物培养分离到2株细菌,经鉴定其中1株为蜡样芽胞杆菌。对各地区褐黄血蜱半饱血雌成蜱和吸血雄成蜱中肠菌群结构分析结果表明其带菌情况基本相同,但饱血雌成蜱3个地区间具有较大的差异;而饱血雌蜱和其它两种状态下的蜱肠道菌群也有差异。贝纳柯克斯氏体、菊欧文氏菌、肺炎克雷伯菌及软腐果胶杆菌是褐黄血蜱中肠内的优势菌。本研究利用PCR-DGGE技术分析褐黄血蜱中肠内容物,为蜱传播疾病的研究奠定基础。     

基于16S.rRNA高通量测序技术分析生鲜水牛乳在加工前的细菌多样性

本研究利用16S rRNA高通量测序分析生鲜水牛乳加工前的细菌多样性。分别提取刚挤出30min内,及冷藏5h、12h及24h的水牛乳样本细菌总DNA,PCR扩增其16S rDNA,利用纯化后的扩增片段构建其菌群的16S rDNA文库,采用Miseq PE300进行高通量测序及BLAST比对。结果显示,在属水平,刚挤出30min～冷藏5h组中的优势菌属为金黄杆菌属(39.28%)、巨型球菌属(16.47%)、乳球菌属(9.61%),而在冷藏12～24h组中则以不动杆菌属(34.95%)、芽孢杆菌属(11.2%)、库特氏菌属(9.01%)为优势菌属。葡萄球菌属在刚挤出组中未检出,但随着冷藏时间的延长,其丰度呈上升趋势。可以得出,生鲜水牛乳从刚挤出至冷藏24h内,其微生物群落结构和组成呈动态变化,且此次测序中条件致病菌检出率较高,冷藏12h后样本组中细菌多样性显著高于其他组,由此可知生鲜水牛乳从挤出至加工前,低温贮藏时间越短越好,最好控制在5h内。     

甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原鉴定

结合形态学与分子生物学特征对甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类进行了鉴定,在KB培养基上对两株典型菌株的菌落形态和培养特征进行了观察和描述,16S rDNA序列测定和同源性比对结果表明两菌株的16S rDNA序列分别与GenBank数据库已知胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌的序列同源性均达99%,其片段大小分别为1 386 bp和1 379 bp。致病性测定结果表明,2种菌均能引起洋葱鳞茎软腐病,且洋葱基部的发病程度高于顶部,其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的致病力强于格氏沙雷氏菌。按柯赫氏法则初步确定甘肃省嘉峪关市洋葱鳞茎软腐病病原种类为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和格氏沙雷氏菌2种,由格氏沙雷氏菌引起的洋葱鳞茎软腐病属首次报道。本研究将为洋葱软腐病的防治提供理论依据。     

牛瘤胃微生物的分离鉴定与生化特性分析

【目的】 通过对瘤胃液中分离所得的菌株进行研究，为益生菌制剂的制备提供基础数据。【方法】 采集10头健康荷斯坦奶牛的瘤胃液，通过涂布、特性培养、纯化等步骤获得单一菌株，提取细菌DNA，进行16S rDNA的PCR扩增。通过16S rDNA基因测序鉴定后进行序列比对并构建系统发育树，确定菌株种类。对不同种类的细菌进行0~48 h的培养测定其生长特性，并进行耐酸碱和耐胆盐试验。【结果】 通过涂布分离菌株得到20株分离菌，经PCR扩增后测序发现20株菌属于7种不同的菌，大致确定L7为解淀粉芽孢杆菌、K7为枯草芽孢杆菌、S7为嗜麦芽窄食单胞菌、C2为地衣芽孢杆菌、M7为马链球菌、F7为弗氏酸柠檬杆菌、T7为吉氏库特菌。通过生长曲线可以看出，7株菌分别在24~36 h达到最快生长期。M7和K7对酸有较强的耐受性，而S7、C2和F7对酸性较为敏感，C2对碱的耐受性最强，而T7对胆盐的耐受性最强，S7对胆盐最不耐受。【结论】 本研究从瘤胃中分离得到的7个菌株对酸碱和胆盐具有不同程度的耐受性，以及最适生长周期。     

Pathogen Analysis of Bovine Respiratory Disease Complex

To investigate the pathogen of bovine respiratory disease complex (BRDC) of a dairy farm in Guangxi, a strain of Mycoplasma and a strain of gram-negative pathogenic bacterium were isolated and identified by the means of field surveys, clinic observation, pathological examination, isolation studies and so on.Treatments were taken according to drug sensitivity test results.The Mycoplasma strain, growing on PPLO medium, formed typical "fried egg" colonies.A 448 bp of oppF fragment was amplified by PCR from the strain and had 98.4% nucleotide identity with Mycoplasma bovis reference isolate PG5 of USA.The biochemical features of the gram-negative bacterial isolate were same with Serratia marcescens.The PCR amplified 16S rDNA of the gram-negative pathogenic bacterium strain was 1 400 bp.It shared 99.0% nucleotide identity with other Serratia marcescens reference strains obtained from GenBank.Animal experiment showed that the gram-negative pathogenic bacterium isolate could cause the mice to die.The drug sensitivity tests showed all isolates were sensitive to spectinomycin, azithromycin, amikacin, gentamicin and neomycin.It was effective to treat with dexamethasone and spectinomycin.Pathogen analysis and drug treatment showed that the BRDC was caused by Mycoplasma bovis and Serratia marcescens.     

牛呼吸道疾病综合征病例的病原分析

本试验旨在查清广西某牛场1起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)病例的病原,指导牛场进行疾病防控。采取现场调查、临床症状与病理变化、病原分离鉴定等方法对病例病原进行分析,根据病原药敏试验结果进行治疗。从病例的肺脏组织中分离到1株支原体和1株革兰氏阴性致病杆菌。支原体分离株在PPLO固体培养基上可见典型的"煎蛋样"菌落,PCR扩增出牛支原体oppF基因特异性的448 bp目的片段,其oppF基因序列与美国分离的牛支原体国际标准株PG45的核苷酸序列同源性为98.4%。革兰氏阴性细菌分离株生化特性符合黏质沙雷氏菌特性,其16S rRNA基因PCR扩增出1 400 bp的目的片段,测序结果与GenBank上登录的黏质沙雷氏菌的核苷酸序列同源性达到99.0%,对小鼠具有致病性。牛支原体和黏质沙雷氏菌分离株均对壮观霉素、阿奇霉素、阿米卡星、庆大霉素和新霉素高度敏感,用高敏药物壮观霉素联合地塞米松等相关措施进行治疗,收到良好效果。结果表明,引起这次牛呼吸道疾病综合征的病原为牛支原体和黏质沙雷氏菌。     

家养观赏地图鱼肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌与黏质沙雷氏菌的分离鉴定及耐药性分析

本试验旨在通过细菌分离鉴定,明确家养观赏地图鱼的死因,筛选敏感药物。采用常规方法分离纯化细菌后,进行细菌形态学观察,并通过小白鼠致病性试验、细菌主要生化鉴定、16SrDNA序列测定分析、药敏试验及耐药基因检测等方法对分离的细菌进行鉴定及耐药分析。分离出3株革兰氏阴性短杆菌,根据细菌形态特征及理化特性,结合16SrDNA序列测定与系统发育分析结果,判定其分别为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens),其中肺炎克雷伯氏菌具有较强致病性。3株细菌均对洛美沙星、氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感,对阿莫西林、氟苯尼考、克林霉素、甲硝唑等具有较强耐药性。结果表明,肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌、黏质沙雷氏菌的混合感染是家养观赏地图鱼的死亡原因。     

四川白三叶根瘤菌遗传多样性及系统发育研究

为阐明四川部分地区野生白三叶根瘤菌的遗传多样性及系统发育地位,对分离自四川雅安、康定、泸定、西昌、成都和乐山6个地区白三叶根瘤的69株菌进行系统研究。采用16S rDNA限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和16S rDNA基因、持家基因(recA、atpD、glnII)、结瘤基因(nodC)、固氮基因(nifH)系统发育分析的方法进行了研究。结果表明,16S rDNA PCR-RFLP中所有供试菌株产生了4种酶切图谱类型,表现出较为丰富的遗传多样性。持家基因与16S rDNA基因系统发育分析结果基本一致,9株代表菌株主要分布在α-变形菌纲(Alpha-Proteobacteria)的根瘤菌属(Rhizobium),并与豌豆根瘤菌三叶草生物型(R. leguminosarum bv. trifolii) ATCC 14480^T的亲缘关系较近。PCR可扩增出nodC和nifH基因片段,但从属于土壤杆菌属(Agrobacterium)的菌株LS1105中则扩增不出这两个基因。所有供试菌株被鉴定到了种的水平,证实了68株为白三叶根瘤菌,并通过不同采样地点菌株之间的比较,发现白三叶与根瘤菌的共生关系因地理分布不同而具有多样性,对于丰富白三叶根瘤菌资源及其开发利用具有重要意义。     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物分离鉴定及多样性分析

研究为分离获得荷斯坦奶牛瘤胃内容物中的细菌,建立系统进化树,获取有益菌种。采用培养组学技术和16S rDNA分子鉴定方法相结合,对3头健康荷斯坦奶牛瘤胃内容物中细菌进行分离培养。共分离得到105株细菌,包括肠球菌属(Enterococcus)共15株14.29%,芽孢杆菌属(bacillus)共11株10.48%,不动杆菌属(Acinetobacter)共14株13.33%,葡萄球菌属(Staphylococcus)共22株20.95%,梭菌属(Clostridium)共1株0.95%,狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)共2株1.90%,短杆菌科(Brevibacteriaceae)共2株1.90%,链球菌属(Streptococcus)共11株10.48%,气球菌属(Aerococcus)共4株3.81%,柠檬酸杆菌属(Citrobacter)共14株13.33%,杆菌属(Brachybacterium)共1株0.95%,克雷伯氏菌属(Klebsiella)共1株0.95%,普罗维登斯菌属(Providencia)共3株2.86%,沙雷氏菌属(Serratia)共4株3.81%。结果中所占比例最高的菌属是葡萄球菌属;系统进化树分析和GenBank中的同源性比对结果发现,从细菌门、纲、目、科、属、种分析,分支明确;26个菌种同源性都在95.01%~100%之间。分离纯化出11株芽孢杆菌属(Bacillus)细菌具有潜在益生菌活性。可作为饲料添加剂饲喂荷斯坦奶牛。     

鹿场环境中细菌的分布及耐药性调查

为探究辽宁省西丰县鹿场环境中细菌的分布及耐药性情况,本试验采集了鹿场粪便、饮水、空气、饲料等样品,进行了细菌的分离培养及鉴定,对分离到的菌株16S rDNA基因进行PCR扩增、测序分析,并对分选出的致病菌和条件致病菌进行药敏试验。结果显示,所测样品共分离纯化出27株菌,公鹿精饲料、母鹿精饲料、粗饲料和水的含菌量分别为1.0×10⁵、8.7×10⁴、2.7×10⁷ CFU/g和2.9×10⁴ CFU/mL,表明水和粗饲料不符合国家规定的养殖场环境卫生要求;16S rDNA基因序列在NCBI比对后,鉴定出有大肠埃希菌、志贺氏菌等15种不同菌株,其中致病菌和条件致病菌共13种,这13种细菌对呋喃唑酮、多黏菌素B和头孢氨苄等耐药,对头孢曲松、环丙沙星和丁胺卡那等药物敏感。本试验结果可为鹿场细菌性疾病的防控及用药提供参考依据。     

细菌16SrDNA基因芯片的构建及应用

本试验为建立能检测兽医临床重要病原菌的基因芯片方法,采用通用引物扩增菌株16S rDNA V1-V3区,制备16SrDNA PCR产物基因芯片,对5种兽医临床微生物进行检测.结果显示,制备的基因芯片能特异性地检测金黄色葡萄球菌、链球菌和鸡毒支原体,以及这3种菌株混合样品,但对大肠杆菌及沙门菌检测结果不理想.基因芯片检测灵敏度为3μg/L.