几株桑天牛成虫肠道优势细菌的分离与鉴定

为了研究桑天牛成虫肠道微生态环境,探索破坏桑天牛营养利用等功能的生物防治新途径,对健康桑天牛成虫肠道的优势细菌进行分离鉴定。选择平皿上出现3个以上的菌落作为肠道优势细菌进行分离纯化,共获得6个菌株。6个菌株均呈杆状,革兰染色和氧化酶反应均呈阴性,在25～35℃、pH 5.5～9.5的环境中生长良好,但各菌株的菌落形态及多种生化性状有差异。通过菌体形态观察、染色反应、生理生化特征分析及16S rDNA碱基序列测定与同源性分析,鉴定1、2、3号菌株分别为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),4、5、6号菌株分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)。     

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群

利用PCR-DGGE技术分析桑天牛成虫肠道菌群结构及优势菌群,获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛成虫肠道中提取细菌基因组DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物27F/1495R和27F/519r+GC进行V3可变区PCR扩增,将长约500 bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离后,进行优势条带分析、DNA回收、克隆、测序等,初步得到分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)的8个细菌菌株,其中优势细菌为克雷伯氏菌属的细菌菌株,其次是沙雷氏菌属的细菌菌株。将获取的细菌16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析,相似度在97%以上的有6个菌株,其中有5个菌株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致,表明基于16S rDNA的PCR-DGGE技术可用于桑天牛肠道菌群多样性研究。     

提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的2种方法比较

比较了改良CTAB法和改良SDS法两种提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的方法,结果表明：改良SDS法提取的DNA杂质较多,并且有部分降解;改良CTAB法提取的DNA纯度较高,适用于后续试验研究.     

桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化

为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR反应体系和程序,采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA,通过L16(45)正交组合试验和单因素梯度试验对MgC l2、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,采用改良的CTAB方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA质量较高,适宜于PCR扩增分析。25μLPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 2.5μL,MgC l22.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,随机引物0.48μmol/L,TaqDNA聚合酶0.75 U,模板DNA 75 ng;退火温度60℃,循环次数30次。