基于FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

利用在大肠杆菌中表达的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白作为包被抗原,建立了检测抗禽腺病毒血清4型(FAdV-4)中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的最佳条件为:抗原最适包被量为0.25μg/孔,包被时间为37℃1h,然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1∶800,作用时间为2h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡IgY,稀释度为1∶4 000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用条件为室温5 min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.055 3判为阳性,小于0.041 8判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法有较好的特异性,组内和组间重复的最大变异系数为5.6%和5.7%,所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液综合征病鸡的血清样品进行检测,阳性检出率为98%,与FAdV-4病原学检测结果符合率为100%。结果表明:本试验所建立的ELISA方法可用于抗FAdV-4中国流行株抗体的检测,为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。     

表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。     

SPF蛋鸡人工感染鸡杆菌的病理形态学观察

采用鸡杆菌自然病例分离纯化的鸡杆菌人工感染开产前(105日龄)和开产后(163日龄)的SPF蛋鸡,运用组织学的方法对鸡杆菌自然病例和试验病例进行比较病理学观察。结果表明,自然病例和试验病例均可引起蛋鸡产蛋高峰推迟,产蛋量下降,且多产畸形蛋;病变主要在呼吸道和生殖道,主要表现为呼吸道和生殖道黏膜层严重充血、水肿、浆液性及炎性渗出等反应。但是试验病例未出现自然病例中常见的腹膜炎和输卵管炎症状。输卵管的病变主要在膨大部和子宫部,这种特征性病变可作为该病病理诊断的重要指征之一。这表明鸡杆菌单因子感染可引起SPF开产蛋鸡生产性能明显降低以及呼吸道和生殖道的病理变化。     

胞内劳森菌LsaA蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立胞内劳森菌特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的胞内劳森菌表面蛋白LsaA的编码基因克隆于pET32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的重组LsaA蛋白作为包被抗原,通过一系列条件优化,建立了检测胞内劳森菌抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法可以特异地检测抗胞内劳森菌抗体,与大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等常见猪腹泻病原的抗血清均无交叉反应。来自PCR检测粪便呈胞内劳森菌阳性猪的血清,用所建立ELISA检测均为胞内劳森菌抗体阳性。该方法具有较好的敏感性和重复性,阳性血清经过1∶800稀释检测结果仍为阳性,批内和批间重复试验的变异系数分别为0.352%~2.752%和0.877%~3.000%。应用建立的ELISA方法对河南省部分地区猪场胞内劳森菌的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区猪场均存在不同程度的胞内劳森菌抗体阳性,阳性率在13.3%~57.1%,平均阳性率为30.6%。结果表明,本研究所建立的ELISA方法可以用于胞内劳森菌抗体的检测,为胞内劳森菌感染的监测和流行病学调查提供了方法。     

IBV肾型毒株与呼吸型疫苗株鉴别方法的建立与应用

[目的]建立基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的反转录-复合PCR方法,为IBV流行毒株和呼吸型疫苗株的分型鉴定提供技术支持.[方法]根据IBV N基因序列设计合成1对特异性通用引物,建立IBV的分子生物学检测方法,用以对IBV进行检测.通过对GenBank上公布的IBV S1基因全序列的分析比对,找出呼吸型疫...     

高致病性禽腺病毒4型中国流行株在LMH细胞中的增殖规律

为研究禽腺病毒4型(FAd V-4)中国流行株在鸡肝癌上皮细胞系(LMH)中的生长特性和增殖规律,分别利用SYBR Green I实时荧光定量PCR和病毒滴度测定方法检测FAd V-4感染LMH细胞后12、24、36、48、60、72、84、96和120 h的基因组复制和病毒粒子增殖动态。结果显示,FAd V-4中国流行株在LMH中能够很好增殖,不同时间点的病毒滴度与病毒基因组拷贝数呈正相关,病毒收获的最佳时间为感染后60 h。研究结果为防控鸡肝炎-心包积液综合征疫苗的研发和生产提供一定的依据和参考。     

表达PEDV中国变异株S基因重组猪伪狂犬病病毒的构建和纯化

为了研制出能够同时预防猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的二联活疫苗,本研究将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和PEDV中国变异株的纤突蛋白免疫决定簇区域(S1)基因分别克隆至含有PRV胸苷激酶(TK)基因上、下游同源臂的穿梭载体pTK中,构建重组PRV转移质粒pTK-EGFP和pTK-S1。将重组质粒pTK-EGFP与PRV疫苗毒株Bartha-K61基因组DNA共转染Vero细胞,经绿色荧光蚀斑纯化得到重组病毒rPRV-EGFP。随后将重组质粒pTK-S1与rPRV-EGFP基因组DNA共转染Vero细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,蚀斑纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV-S1。本研究将为更有效防控猪伪狂犬病和猪流行性腹泻提供辅助工具。     

我国部分地区蛋鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查

为了解鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在我国部分地区鸡群中的感染状况,本实验采用G.anatis微量凝集试验对我国河南、山东和山西等不同地区的1 314份鸡血清样品进行了G.anatis感染的血清流行病学调查,对G.anatis的感染率、感染品种、日龄等进行分析。结果表明:我国河南、山东和山西等地鸡群均存在G.anatis感染,其中G.anatis血清Ⅰ型抗体阳性率为11.95%,G.anatis血清Ⅱ型抗体阳性率为23.29%,G.anatis血清Ⅳ型抗体阳性率为9.82%。不同省份的鸡群感染G.anatis的血清阳性率存在一定差异,河南、山东和山西的血清阳性率分别为23.12%、25.27%和52.94%。对河南地区不同品种和日龄鸡的调查表明,均存在不同程度的感染,但血清阳性率有显著差异,表现为罗曼鸡的血清阳性率比海兰鸡高,开产前蛋鸡的血清阳性率低于开产后的血清阳性率。     

河南及山西省21株鸡杆菌分离株16SrRNA基因序列分析

对21株分离自河南及山西地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列进行研究,以此分析分离株的进化关系并确定其在鸡杆菌属中所属的具体种。采用PCR方法扩增其16SrRNA基因序列,然后克隆测序。用DNAStar软件对21个菌株的序列及GenBank中已公布的鸡杆菌属相关菌株序列进行同源性比较,结果发现21株分离株之间的核苷酸序列同源性为96．0oA～100％,同鸭源鸡杆菌F279（Gallibacteriuman atis F279）（AF228002）的同源性为95．3％～99．3％,同输卵管炎鸡杆菌F150（Gallibacterium salpingitidis F150）（EU424000）的同源性为88．3％～91．5％,同虎皮鹦鹉鸡杆菌F450（GallibacteriummelopsittaciF450）（EU339196）的同源性为90．3％～93．3％,同海藻糖发酵鸡杆菌52-S3-90（Gallibacteriumtrehalosi fermentans52-s3—90）（EU339199）的同源性为88．2％～91．4％,同多杀性巴氏杆菌CCUG179（P．multocida CCUG17977）（AF294411）的同源性为85．5％～88．8％,对21株细菌的序列同以上菌株的16SrRNA基因序列进行遗传进化树分析,显示21株细菌同鸭源鸡杆菌F279（AF228002）构成一个单独的大分支。结果表明,所有分离株均属于鸭源鸡杆菌,首次大量报道了来源于河南、山西省不同地区的鸡杆菌的16SrRNA基因序列,为鸡杆菌分类的研究提供了参考。