MID2对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的调控作用

本试验旨在研究MID2(midline 2)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)复制的调控作用。首先用PRRSV BJ-4毒株感染MARC-145细胞，通过RT-qPCR和Western blot技术分别检测MID2的mRNA转录水平和蛋白表达水平，发现PRRSV感染能够上调MID2的表达。为了进一步探究MID2对PRRSV复制的影响，本研究过表达或沉默MID2表达，再接种PRRSV,通过RT-qPCR和Western blot技术，检测PRRSV ORF7的转录水平及N蛋白的表达水平，结果显示MID2能够抑制PRRSV复制。随后将pCMV-Flag-MID2和pGL3-IFN-β-Luc真核表达质粒共转染到HEK293T细胞中，通过双荧光素酶报告基因试验检测IFN-β的启动子活性，结果表明MID2能够正调控I-IFN信号通路。最后将MID2与RIG-I的真核表达质粒共转染到HEK293T细胞中，通过Co-IP试验发现MID2和RIG-I存在相互作用，且MID2能够以剂量依赖的方...     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子，探究该基因的表达调控机制，本研究以民猪基因组DNA为模板，通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段，与pMD18-T载体连接构建克隆质粒；通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒；将重组质粒转染PK15细胞系，利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性；根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域；利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点，根据预测结果，使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体，在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明，试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段，其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现，-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域，经生物信息学分析发现，该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体，经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失，会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

鸡IFN-β启动子荧光素酶报告载体的构建与活性检测

构建并鉴定鸡β干扰素(IFN-β)基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行转录活性分析.通过PCR方法从鸡基因组DNA中克隆鸡IFN-β基因启动子,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-basic载体上,构建鸡IFN-β基因启动子荧光素酶报告基因载体pChIFN-β-luc;用脂质体法将构建的报告基因载体瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,并设置空白对照组和poly(I:C)处理组,检测荧光素酶的活性.经PCR扩增出鸡IFN-β基因启动子序列,双酶切及测序鉴定各重组体构建正确;转染后检测,pChIFN-β-luc具有转录活性,并且在poly(I:C)的刺激下其荧光素酶活性显著升高.本试验为进一步研究鸡IFN-β基因转录调控机制奠定了基础.     

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增，将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中，构建了重组质粒pET-nsp4，测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21（DE3），用IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明，重组菌可表达分子质量约23ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化，获得了高纯度的重组蛋白，Western-blot分析结果表明，nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核表达质粒在小鼠的细胞免疫应答

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫.     

猪蓝耳病毒衣壳N蛋白的原核诱导表达及鉴定

本实验首先双酶切含有Hind3和Nco I酶切位点的PRRSV目的基因的质粒p UC-57—PRRSV N gene,利用酶切的目的基因与表达载体p ET-28a,,构建重组表达载体p ET-28a-PRRSV N gene,为实现目的蛋白原核表达,建立针对该病的快速、有效的检测方法研发安全高效的疫苗等针对猪群PRRSV进行后续研究的奠定基础和前提条件。     

猪RNase L与PRRSV nsp4缺失突变体的构建及其互作研究

RNase L是一种独特的核糖核酸内切酶,在机体的抗病毒过程中发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白4(nsp4)具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体切割的主要蛋白酶,是影响病毒粒子成熟的重要蛋白。课题组前期研究发现猪RNase L(sRNase L)能够与nsp4互作发挥抗PRRSV作用。为了筛选sRNase L与nsp4互作的区段或位点,本研究分别构建了sRNase L与nsp4的截短体或突变体,通过免疫共沉淀试验进行筛选,结果显示突变体sRNase L R460A、sRNase L R675A、sRNase L Y720A、sRNase L F724A都能够与nsp4发生互作,只有缺失体sRNase L 1～586 aa不与nsp4互作,表明sRNase L第3结构域(587～744 aa)为与nsp4互作区段,但该区段不包括第675位精氨酸、第720位酪氨酸、第724位苯丙氨酸;分别包含nsp4三个结构域的截短体nsp4-D1(1～80 aa)、nsp4-D2(60～156 aa)、nsp4-D3(157～204 aa)中,只有nsp4-D1与sRNase L发生互作,表明nsp4的1～60 aa为与sRNase L互作区段。本研究为进一步探究sRNase L与nsp4互作抗PRRSV机制奠定了基础,为预防和控制PRRSV感染提供了新的思路和方法。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

Am80和TSA对鸡Stra8基因启动子活性的调控作用

旨在确定鸡Stra8基因启动子的主要调控区域,预测调控元件结合位点,探索用他米巴洛丁(Am80)或曲古抑菌素(TSA)诱导对Stra8启动子活性的调控作用。将鸡Stra8基因5′侧翼系列缺失片段插入到pGL3-basic载体构建重组质粒,并转染DF-1和GC-1,通过检测荧光素酶活性和预测启动子区域调控元件的结合位点,选取合适的启动子片段并构建其重组质粒Stra8-EGFP;将Am80和TSA分别按一定的浓度梯度诱导转染细胞,进行荧光素酶活性检测以筛选最佳诱导浓度;用最适剂量的Am80和TSA分别单独或联合诱导转染重组质粒Stra8-EGFP的P19,并检测各诱导组的绿色荧光表达程度。结果表明,鸡Stra8基因启动子-1 055~+54bp片段的活性较强,且含有RARα、RXRα和RARβ的结合位点;分别单独或联合使用Am80和TSA对转染的细胞进行诱导,结果显示,Am80和TSA协同作用的荧光素酶活性最高;重组质粒Stra8-EGFP转染细胞后,用Am80(10-5 mol·L-1)和TSA(10-6 mol·L-1)联合诱导可见绿色荧光强度最强。本研究成功分析了鸡Stra8基因启动子的活性和调控元件的结合位点,确定Am80和TSA共同诱导可显著提高Stra8基因启动子调控活性。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。     

鸡IL-2和IL-4融合基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

为提高鸡球虫病活疫苗的免疫效果并降低其副作用,本试验用合成的鸡白介素2(chIL-2)和鸡白介素4(chIL-4)基因片段构建3个融合基因真核表达质粒,并利用脂质体法将其转染至原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其表达水平,MTT法测定其表达的分泌产物活性。结果显示：成功构建的pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP、 pCI-chIL-4-EGFP重组真核表达质粒能在原代鸡胚盲肠上皮细胞中高效表达;3种重组真核表达质粒转染后24～96 h的鸡脾淋巴细胞活性极显著高于空载组(P<0.01),且在72 h时达峰值;而单一因子组鸡脾淋巴细胞增殖活性极显著低于pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP组(P<0.01)。由此可见,本试验成功构建了能表达分泌chIL-2和chIL-4的融合基因重组质粒;且chIL-4-chIL-2融合蛋白生物学活性显著高于单一因子。     

猪孕烷X受体基因真核表达载体的构建与表达

为构建猪的孕烷X受体(PXR)基因真核表达质粒,用RT-PCR技术从新鲜猪肝中扩增到猪孕烷X受体(pgPXR)基因,将其连接到真核表达载体pCI-neo中,得到重组质粒pCI-pgPXR。对该重组质粒进行PCR、测序及酶切鉴定后,采用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞,用RT-PCR和双荧光素酶检测系统进行鉴定。结果表明,猪孕烷X受体基因真核表达质粒pCI-pgPXR构建成功,可在HepG2细胞中表达,为猪孕烷X受体的药理学和毒理学研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后，S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别，并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响，本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段，并分别克隆至pCAGGS载体中，构建重组质粒pRRRR-Flag、 pSRAS-Flag、 pAAAA-Flag，均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞，48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T；利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系，并均经western blot鉴定。结果显示，上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、 RRR...     

关岭牛MyoD I基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性,初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板,设计5'端加磷的引物,PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子,定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区,构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞,依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示,MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高;目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区;重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达,细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I,4个启动子均具有启动活性,其中P3启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高,初步推断P3启动子为该基因的核心启动子。     

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1毒株毒力基因UK,获得重组蛋白(DP96R),进一步制备并鉴定DP96R重组蛋白的多克隆抗体。首先构建原核重组表达质粒pET-28a-UK并转化BL21感受态细胞,在16℃、0.4 mmol/L IPTG条件下诱导10 h后,检测到目的蛋白以可溶性表达为主,蛋白分子量约为15 kDa。然后采用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DP96R蛋白多克隆抗体。ELISA结果表明制备的多抗具有良好反应性,Western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的DP96R蛋白。DP96R重组蛋白及多克隆抗体的制备为进一步研究DP96R蛋白的生物学功能以及建立ASFV毒株鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒（GPV）H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEX HTb-VP3中切取GPV H1株VP3基因片段，将其亚克隆于pSY538的EcoRI位点，并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用Not I切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，亚克隆于pSY681的NotI位点，构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明：试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;...     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。