S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。     

马流感病毒的分离及其亚型的初步鉴定

1994年春我国西宁市附近暴发了马流感。本试验从现地典型发病又未经治疗的马采集了鼻甲、鼻分泌物、脾、咽、血液,用9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔接种、传代,进行病毒分离。最后从脾和鼻甲粘膜分离到2株病毒,经血凝试验和电镜检查,证明是马流感病毒,经标准毒株和抗标准毒株亚型抗血清以及现地采集的耐过马血清交叉进行血凝抑制试验证明该病毒为A型流感病毒A2亚型,命名为A/马-2/西宁/94。     

马属动物cyclinT1基因的扩增与真核表达载体的构建

在幔病毒复制过程中cyclinT1(CycT1)是重要的辅助因子.为了揭示慢病毒的复制机理,试验使用RT-PCR方法扩增马和驴的cyclinT1基因,并进行克隆和序列分析,然后用DNASTAR(MegAlign)软件将测得的序列和国外发表的马属动物CycT1序列(GenBank中登录号为AF137509和AF190905)进行同源性比较.结果表明:马属动物CycT1大小为2 184 bp,编码727个氨基酸;4种CycT1基因氨基酸同源性在98%以上;将扩增出的马CycT1基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切及测序鉴定证实成功构建了pcDNA3.1(+)/eCycT1重组质粒.     

鸡IL-4和IL-2重组融合基因佐剂对鸡球虫活疫苗的增效作用研究

为了研究鸡白细胞介素4(IL-4)和IL-2重组基因佐剂pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP对鸡球虫活疫苗的增效作用,试验采用基因佐剂配合鸡球虫活疫苗对雏鸡进行免疫攻毒试验,测定该基因佐剂的最小有效剂量、给药途径,使用该基因佐剂对鸡球虫活疫苗的最短免疫间隔时间和免疫产生期的影响。结果表明：抗球虫指数(ACI)和相对增重率(RWG)随着基因佐剂剂量增高而升高,肌肉注射100μg/只时,ACI(189.32)和RWG(90.35%)达到高峰;口服基因佐剂300μg/只组的ACI(188.41)与肌肉注射基因佐剂100μg/只组接近;肌肉注射佐剂免疫攻毒组的两次免疫最短间隔时间(6 d)较不加基因佐剂组(7 d)缩短1 d;肌肉注射佐剂免疫攻毒组的免疫产生期为二免后第5天,较无基因佐剂免疫攻毒组提前1 d。说明肌肉注射IL-4和IL-2重组基因佐剂pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 100μg/只可提高鸡球虫活疫苗的免疫效果,缩短免疫产生期和免疫间隔。     

通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAV_(FDDV12)体内复制的影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。     

EGF和FGF-2对猪皮下脂肪神经嵴干细胞增殖和分化的影响

【目的】探究表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF-2）对猪皮下脂肪神经嵴干细胞（neural crest stem cells,NCSCs）增殖及分化的影响,以优化猪皮下脂肪神经嵴干细胞的培养条件。【方法】通过体外分离培养原代猪皮下脂肪NCSCs,免疫荧光染色鉴定NCSCs标志物p75 NTR,并用不同浓度的EGF和FGF-2（0和0、10和10、10和20、20和10、20和20、30和30 ng/mL）作用于传代猪皮下脂肪NCSCs,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖率,确定细胞生长的最适EGF和FGF-2浓度,将试验分为空白组和最适浓度组,测定两组细胞的生长曲线,成脂化诱导后油红O染色,对比两组细胞的脂滴生成量。【结果】免疫荧光染色结果显示,原代猪皮下脂肪NCSCs经p75 NTR鉴定呈阳性。CCK-8细胞增殖试验结果显示,EGF和FGF-2的浓度均为20 ng/mL时对传代猪皮下脂肪NCSCs的促增殖作用最佳。生长曲线显示,两组细胞均在第5~9天处于对数生长期,第10~15天细胞增殖减缓,逐渐到达停滞期。油红O染色结果显示,最适浓度组胞质内的脂滴生成量远多于对照组。【结论】在培养液中添加20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF-2对猪皮下脂肪NCSCs的增殖和分化有促进作用。     

猪群HEV血清抗体调查及一株新的猪HEV ORF2部分基因序列分析

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)主要引起人的戊型肝炎,新近研究发现猪在病毒传播中可能发挥重要作用.本研究对我国部分省区HEV感染血清学调查,在被检的1 138份血清中,有666份(57.5%)为HEV抗体阳性,猪群抗体阳性率随着月龄增长而升高.通过RT-PCR方法从一份猪粪中扩增并克隆了HEVORF2 N端主要抗原决定区339bp基因片段,序列分析显示,该段基因与我国人群HEV基因4型毒株核苷酸序列同源性为85.9%,但氨基酸序列完全一致.这一结果提示我国猪群存在广泛的HEV感染,并在一定程度上与人群HEV毒株密切相关.     

猪瘟兔化弱毒牛体反应疫苗简介

猪瘟是一种毁灭性传染病,遍及全世界,死亡率为80～90％。巴黎国际兽医局(OIE)的国际卫生法规,将猪瘟列入A类16种法定传染病之一. 50年代我国和世界其他国家均用猪瘟结晶紫 疫苗预防猪瘟,生产这种疫苗的原材料需用猪,利用率仅50～60％、每头猪(50kg)生产的疫苗仅能预防300头猪,生产周期要2.5个月,效力只有70％左     

山羊关节炎-脑炎ELISA方法的建立及其应用

 应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA），检测了山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）试验感染山羊和自然感染山羊的血清抗体，确定了最适宜的反应条件。CAEV感染山羊血清终点滴度结果表明：ELISA比琼脂扩散试验（ID）敏感性高，对自然感染山羊检出率比ID高3%左右。CAE标准阳性血清和自然感染阳性血清预先被特异性抗原中和后的ELISA反应均呈阴性，从而证实了本方法的特异性。因此，本方法适于CAE的流行病学调查和监测工作。     

中国3种旧大陆猴TRIMCyp嵌合基因的存在状况及基因特性研究

本研究应用PCR方法检测了中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)的TRIMCyp嵌合基因型个体的存在状况,并首次发现携带TRIMCyp嵌合基因中国品系恒河猴。同时本实验应用建立RT-PCR方法在mRNA水平上进一步检测了恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp嵌合基因序列和特性。其编码的融合蛋白TRIMCyp丧失了对HIV-1复制的限制功能,推测具有该基因型旧大陆猴对HIV-1更易感,可用于建立新型的艾滋病非人灵长类动物模型。本研究结果将促进逆转录病毒跨种间传播的研究和建立HIV-1易感非人灵长类动物模型。