CRISPR/Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定点敲入

为研究山羊乳蛋白基因编辑，实现羊乳“人源化”改造。利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白（BLG）基因，同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白（hLF）基因。针对山羊BLG基因第一外显子设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性；将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞，经筛选检测获得BLG~-/hLF~+打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植；通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况。结果表明：sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30%～35%；共筛选72株药物抗性细胞株，其中有37株为基因打靶细胞，打靶效率为51.4%(37/72）；挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植，共制备416枚重构胚，移植30只受体山羊；30-35日龄B超诊断有13只受孕，妊娠率为43.3%(13/30）；剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG~-/hLF~+基因型，并建立了BLG~-/hLF~+靶向性修饰细胞系。因此，利用CRISPR/Cas9系统可以获得BLG基因座定点打靶hLF基因的转基因克隆山羊，该研究为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系提供了科学依据。     

人白介素-2基因打靶载体的构建、转染及鉴定

为研究人白介素2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBCI为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2．5kb和下游3．5kb的序列作为5’和3’同源臂,将克隆得到的人白介素2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBN153。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介紊-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶裁体pBN153成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植法制备人白介素-2基因乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

山羊胎儿成纤维细胞中基因打靶的初步研究

为评估在山羊胎儿成纤维细胞中通过同源重组进行基因打靶的可行性，构建打靶载体pTargetl，分别以山羊β-酪蛋白基因的5’、3’侧翼区为2条同源臂，中间插入正筛选基因(Neo’)，外侧插入负筛选基因(HSV-tk)。将该载体线性化并纯化后电转染人30日龄的山羊胎儿成纤维细胞中，转染细胞系分别用G418和丙氧鸟苷进行正负药物筛选，存活细胞经PCR检测证明发生了同源重组事件。     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列（KY235336）特点,分别在其5'和3'端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5'和3'端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白（mCherry）的DNA片段（CAG-mCherry）替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA（sgRNA1~sgRNA4）均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段（CAG-mCherry）插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。     

奶山羊β—乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组DNA，根据已发表的山羊β－乳球蛋白基因（BLC）序列设计引物，用高保真长模板PCR法克隆得6个奶山羊BLG基因片段，这6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊BLG基因相同，部分序列测定结果显示：6个奶山羊BLG基因片优山关BLC基因相应片段的同源性为99％，进一步序列测定结果表明：奶山羊BLG基因5调控区与山羊，绵羊和牛的同源性分别为99％，95％和90％，3调控区与这些动物的同源性分别为99％，97％和92％，在乳腺特异表达调控元件集中的－406bp区域内，奶山羊BLG基因与山羊BLG基因有2个碱基的差异，所克隆的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同，其同源性仅为83％（上游调控区）和88％（下游调控区），这些结果表明：不同种动物 的BLG基因是高度保守的，高保真PCR克隆的奶山羊BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建。β     

通过CRISPR/Cas9技术打靶兔Myostatin基因

细菌和古生菌利用自身的获得性免疫系统(CRISPR)抵御外来侵略,使外源DNA降解。为了基因突变兔子成纤维细胞的Myostatin基因,研究构建了CRISPR和g RNA质粒,当Cas9与g RNA摩尔数之比分别为1∶2、1∶1时进行转染到兔子成纤维细胞中,结果显示有打靶效率差异,经过鉴定均有碱基突变。结果表明:利用(CRISPR/Cas9)系统可成功突变目的基因。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于绿僵菌

近年来的研究显示,CRISPR/Cas9系统是强有力的基因编辑新技术.以蝗绿僵菌为试验对象,以同源重组敲除系统为对照,研究CRISPR/Cas9系统敲除蝗绿僵菌的基因isp4核苷酸序列.阐明了CRISPR/Cas9载体构建的方法,比较了CRISPR/Cas9和Recombinase敲除技术的异同,最后通过PCR和突变菌株的表型验证了CRISPR/Cas9系统能够应用于绿僵菌.结果表明,CRISPR/Cas9在昆虫病原真菌绿僵菌中是有效的基因编辑技术.     

CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

山羊CSN2基因内含子7靶向的CRISPR-Cas9系统高效切割位点筛选

【目的】使用CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因座内含子7上筛选出高效的切割位点.【方法】根据"20N+NGG"原则在CSN2内含子7序列中设计了5个sgRNA靶向位点.分别连接具有sgRNA到和Cas9表达框的PX330-P2A-eGFP载体上,通过脂质体转染到实验室保存山羊胎儿成纤维细胞系中,PCR扩增转染阳性的细胞基因组CSN2内含子7序列,连接到Pmd19-T载体中,测序比较不同的sgRNA介导切割产生的突变.【结果】使用5个sgRNA均可以在山羊CSN2基因内含子7上造成有效切割,产生碱基删除或者插入突变.实验设计的5个sgRNA介导的CRISPR-Cas9系统效率均在30.7%以上,效率最高的2号位点(sgRNA2)介导的切割效率达到了61.5%.【结论】研究确定了CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因内含子7内进行高效切割的sgRNA,为之后在该基因位点进行高效的非同源介导基因敲入奠定了基础.     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。     

茶炭疽菌中CRISPR/Cas9敲除系统构建

【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例，构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统，为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析，选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段，再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架，以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650～750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段，三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1 200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功，并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。     

靶向兔肌肉生长抑制素基因CRISPR/Cas9载体的构建和活性分析

家兔是研究基因功能和疾病模型的重要模式动物,但目前的兔遗传操作体系急需改进,建立成熟高效兔基因敲除平台具有重要意义。为了探究CRISPR/Cas9基因组编辑系统对家兔肌肉生长抑制素(myostatin,简称MSTN)基因的敲除效率,构建了Cas9/gRNA表达质粒p Cas9/gRNA。将Cas9/gRNA质粒转染到兔纤维细胞,经DNA测序发现p Cas9/gRNA诱导MSTN基因发生碱基缺失和点突变,基因突变效率为23%。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统可在兔成纤维细胞中高效介导MSTN基因突变,为进一步建立高效的基因敲除兔平台奠定了基础。     

牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素（myostation,MSTN）基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。     

甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族，分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体，为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因，分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物，以载体pHSN401为模板，扩增获得sgRNA克隆框，使用Bsa I酶切pHSN401载体，利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌，挑选单克隆进行培养，随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501～605 aa不等，平均分子量约为59 351 Da,等电点为5.04～6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在AMS基因的CDS区设计3个靶位点，分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建...     

1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法

基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。