CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

水肥氮镉耦合下土壤酶活性及玉米生长与镉吸收响应的初步研究

采用正交设计,通过土培盆栽试验,研究水、肥、氮、镉耦合条件下,土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶和中性磷酸酶活性及玉米生长和镉吸收的响应。结果表明,在高镉(2 mg·kg~(-1))条件下,施用有机肥并低量(常规用量的50%)灌溉时土壤过氧化氢酶、脲酶活性最高,而蔗糖酶活性最低。未添加外源镉时,高氮(0.2 g·kg~(-1))条件下的土壤脲酶活性最低,而中性磷酸酶活性最高。在高氮高镉条件下,玉米生物量骤减。随着施氮量(0～0.2 g·kg~(-1))增加,玉米生物量有提高的趋势。随着外源镉添加量(0～2 mg·kg~(-1))增加,玉米地上部镉含量整体呈增大趋势。高氮条件下,添加中量(0.1 mg·kg~(-1))外源镉时,玉米生物量最大,且地上部吸镉量最高。     

教育学专业培养方案修订探讨——基于河南某地方高校毕业生视角

以河南省某高校近3年教育学专业毕业生为调研对象,通过问卷调查、电话访谈等形式对其就业现状进行调查研究,深层次了解教育学专业毕业生的就业去向、发展状况及本科期间对专业学习的满意度等,并对教育学专业培养方案的修订提出了合理有效、切实可行的建议,以期能促进教育学专业进一步发展。     

禽粮耦合在农业转型中的功能与发展机遇

受我国人口、土地、粮食安全、市场经济、膳食结构、集约化生产等因素影响,种养割裂、土地退化、环境风险等系列问题愈发严重。从种植业和养殖业现状出发,分析种植业和养殖业单一生产模式下资源利用、生态环境、食品安全、农业污染方面存在的主要问题.通过禽粮耦合种养一体化,探讨为种而养、为养而种过程中承载的生态功能,展望禽粮耦合在绿色农业中的发展机遇,以期为缓解农业环境压力、增加安全农产品有效供给,为农业转型提供理论依据。     

绿肥压青粉垄保护性耕作对土壤水分入渗及其后延效应的影响

研究绿肥压青下粉垄耕作稻田土壤水分入渗规律对完善稻田保护性耕作体系具有重要意义。2016-2017年,在广西农业科学院试验田设置粉垄保护性耕作与单免保护性耕作两种耕作模式,并设不施肥、常规施肥、单倍绿肥压青和双倍绿肥压青4种施肥处理,然后分别于早稻、晚稻收获后用土壤紧实度仪及单环入渗法测量稻田土壤紧实度及稳定入渗速率,并于晚稻水稻收获后用环刀法测定土壤容重,以了解绿肥压青下粉垄保护性耕作对当季稻田土壤入渗的影响,并就其对后季稻田的后延效应影响进行研究。结果表明,绿肥压青下粉垄保护性耕作对当季和后季稻田0-15cm土壤紧实度的影响不明显,但是可以显著降低15-30cm土壤紧实度。同时显著降低了当季及后季土壤表层及耕层的稳定入渗率,使土壤入渗能力降低,提高了土壤容重,降低了土壤孔隙度,使土壤密实。绿肥压青下粉垄保护性耕作可显著降低后季稻田土壤稳定入渗率和紧实度,对土壤结构及水分入渗的后延效应明显。     

重金属Cu对堆肥过程中微生物群落代谢和水解酶活性的影响

为了探讨重金属Cu对堆肥过程的影响,以猪粪、麦秸、废菌糠为原料并接种复合微生物菌剂,在静态堆肥条件下,研究了Cu对堆肥过程中温度、微生物群落代谢能力和水解酶活性的变化.结果表明,CK处理(不添加Cu)高温期维持5 d(其中55℃以上维持4 d)达到无害化的温度要求;添加Cu处理后,L处理(Cu浓度为100 mg·kg<'-1>)高温期(>50℃)只持续4 d;H处理(Cu浓度为500mg·kg<'-1>)在整个堆肥过程中只有1 d超过55℃,高温期只维持2 d,L、H处理均未达到无害化的温度要求.以Biolog方法为主要检测手段并结合聚类分析和主成分分析方法,分析了重金属Cu对堆肥过程中微生物群落代谢能力的影响,结果表明,低剂量Cu能提高微生物群落对聚合物类碳源的转化与利用的能力,高剂量Cu对微生物群落利用中间代谢物和复杂大分子类碳源产生一定的抑制作用.水解酶活性分析结果表明,低剂量Cu对水解酶有一定的激活效应,高剂量Cu对水解酶有一定的抑制效应.     

小麦秸秆静态高温堆腐过程中的理化特征

为了解小麦秸秆堆肥过程中的生物化学特征,进行了高温好氧堆肥试验.结果表明,添加复合微生物腐解菌剂处理较不添加复合微生物腐解菌剂(CK)升温快,温度高,高温持续时间长;堆腐第2d添加菌剂处理堆体温度上升到50℃以上,第3 d达到最高温度67.1℃,50℃以上持续6 d;CK堆腐第3 d达到50℃,第4 d达最高温度59.5℃,50℃以上持续5 d.堆腐第9 d添加菌剂处理E4/E6值达高峰值3.419,CK的达高峰值4.085,堆腐第23 d后添加菌剂处理的胡敏酸E4/E6值为1.512～1.709,而CK处理的E4/E6值为1.649～2.060,堆腐过程添加菌剂处理的E4/E6值一直低于CK,表明添加菌剂能促进腐殖质的缩合和芳构化.堆肥腐熟后pH值较堆制前有所提高,添加菌剂处理的pH值相对较低,变化幅度较小.加入微生物菌剂处理的电导率(EC)值较高,且在持续高温阶段高于后熟阶段.     

秸秆还田对土壤脱氢酶和多酚氧化酶活性动态变化的影响

通过旱田试验研究了冬小麦生长期内,秸秆还田与肥料配施对土壤脱氢酶活性和多酚氧化酶活性动态变化的影响.结果表明,土壤脱氢酶活性在冬小麦生长期内波动较大,出现多个峰值;秸秆还田和厩肥的施入均能显著提高土壤脱氢酶活性.在冬小麦生长后期,尿素能显著提高土壤脱氢酶活性,而过磷酸钙的施入一定程度上降低了土壤脱氢酶活性.土壤多酚氧化酶活性表现为在冬小麦生长前期和中期活性较低,4、5月份活性迅速升高,出现高峰值,随后在收获期迅速降低;秸秆还田和过磷酸钙对土壤多酚氧化酶活性的影响不显著.在冬小麦生长中期,厩肥和尿素对土壤多酚氧化酶活性有一定的抑制作用,在冬小麦生长旺盛期,厩肥和尿素对多酚氧化酶活性的抑制作用不明显.     

光山县茶产业转型发展调查

正为进一步加快推进光山县茶产业发展,促进茶产业全面转型升级,不断做大做强茶产业,实现兴茶富民,助力精准扶贫。根据河南省经济作物推广站关于茶产业转型发展调研提纲的要求,2018年3月,光山县农村茶叶果树管理站组织专业技术人员,采取走访茶企、实地察看、座谈交流等方式对茶产业转型发展情况开展了调查,现将调查情况介绍如下:一、茶产业发展现状     

耕作对健康耕层结构的影响及发展趋势

土壤耕作与土地生产力密切相关,土壤耕层中的养分影响作物养分的吸收与利用,良好的耕层结构有利于水、肥、气、热之间相互协调。耕层深度与耕作方式有关,构建良好的健康耕层结构,有利于协调作物生长和根系分布。本文结合有关传统翻耕耕作、免耕、旋耕、深耕等对土壤耕层的研究结果,从土壤容重、土壤孔隙度、土壤团聚体、土壤入渗、土壤重金属、土壤呼吸及根系特征等方面,探讨耕作模式对健康土壤耕层构建的影响,并就耕作体系、系统定位、耕作效率、适生作物方面指出目前土壤耕层研究不足,从因地制宜发展耕作方式、建立综合性耕作体系、加快耕作新型农机的研究应用、开展农田小气候环境系统研究方面展望了构建健康理想耕层结构的发展趋势,以期最大限度地提高耕地资源综合生产能力,缓解人地关系矛盾,为农业生产中最佳耕作模式提供理论基础和技术支撑。