卷丹水提物的急性毒性和遗传毒性研究

[目的]评价卷丹的安全性,为其综合利用提供依据。[方法]通过急性毒性试验测定南通军山卷丹水提物的急性毒性及可能的中毒症状,并测定小鼠的最大耐受量。通过小鼠骨髓微核试验对其进行系统安全性评价。[结果]卷丹对小鼠的半数致死剂量（LD50）大于80 g/kg,并且小鼠骨髓微核试验结果为阴性。[结论]卷丹无明显急性毒性反应,无遗传毒性,是一种安全无毒的中药,可开发成中药新药。     

rhPA/GH双转基因兔的制备及rhPA表达检测

【目的】双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路。 【方法】利用NotⅠ/SalⅠ双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段。以3只rhPA单转基因兔（标号K06、K10、K17）作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔。经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平。测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响。【结果】成功获得了约16 700 bp 大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4%（103/122）,显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3%（5/6）,妊娠到期共出生32只仔兔。通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔（7♂,4♀）,双基因整合率为34.4%（11/32）,且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只（标号K06-1、K06-2）、K10供体兔1只（标号K10-1）、K17供体兔1只（标号K17-1）。K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL^-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL^-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL^-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL^-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2 μg·mL ^-1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248 μg·mL ^-1。4只rhPA/GH双转基因母兔（K06-1、K06-2、K10-1、K17-1）乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL^-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔（K06、K10、K17）乳腺的表达含量（15.2-42.8μg·mL^-1）,表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平。Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA。对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年。【结论】成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法。     

CRISPR/Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定点敲入

为研究山羊乳蛋白基因编辑，实现羊乳“人源化”改造。利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白（BLG）基因，同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白（hLF）基因。针对山羊BLG基因第一外显子设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性；将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞，经筛选检测获得BLG~-/hLF~+打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植；通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况。结果表明：sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30%～35%；共筛选72株药物抗性细胞株，其中有37株为基因打靶细胞，打靶效率为51.4%(37/72）；挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植，共制备416枚重构胚，移植30只受体山羊；30-35日龄B超诊断有13只受孕，妊娠率为43.3%(13/30）；剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG~-/hLF~+基因型，并建立了BLG~-/hLF~+靶向性修饰细胞系。因此，利用CRISPR/Cas9系统可以获得BLG基因座定点打靶hLF基因的转基因克隆山羊，该研究为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系提供了科学依据。     

铅对斑马鱼生殖系统毒性作用研究

[目的]研究Pb对斑马鱼生殖系统的毒性作用。[方法]将成年斑马鱼(3月龄)随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(0.4mg/L)、中(0.8 mg/L)、高(1.6 mg/L)剂量PbAc染毒组,每组20条,连续染毒7 d。染毒结束后,测定雌性斑马鱼产卵数和雄性斑马鱼产精子体积以及精子密度。[结果]与对照组相比,0.4和0.8 mg/L Pb染毒组斑马鱼产卵数较低,差异均有统计学意义(P<0.05);1.6mg/L Pb染毒组斑马鱼已不产卵。随着染毒剂量的增高,斑马鱼产卵数呈减少趋势。各Pb染毒组雄性斑马鱼精子密度与对照组比较,差异均无统计学意义。与对照组比较,0.4、0.8和1.6 mg/L Pb染毒组雄性斑马鱼精子体积均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。置换交配试验结果也是类似。[结论]Pb染毒可对成年斑马鱼产生生殖毒性。     

海洋细菌NH-8防治草莓灰霉病机理及其抗菌物质分析

为探讨从海藻分离获得的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis菌株NH-8对草莓灰霉病的防治机理,采用酸沉淀法分析其抗菌活性成分,并从促生、抑菌和诱导草莓防御酶活性方面进行了研究。结果表明:接种菌株NH-8后,草莓体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均有不同程度提高,最大分别为35.4、3.63、51.5、43.8 U;同时接种菌株NH-8和灰霉病菌比单一接种菌株NH-8或灰霉病菌对草莓体内防御酶活性的影响更大,PAL、POD、SOD、CAT活性最大分别为37.5、3.91、55.5、47.6 U。NH-8菌株发酵液对草莓生长具有明显的促进作用,苗株高、鲜重和干重分别比对照显著增加57.58%、131.43%和45.45%;发酵液的粗提物对灰霉病菌具有抑菌活性,可引起菌丝不规则生长,菌丝顶端或中间膨大成泡囊状,引起原生质泄露;NH-8菌株及其分泌物质对草莓具有抗性诱导作用,分泌的抗菌活性产物为伊枯草素(iturin)。     

同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊β-乳球蛋白位点效率的影响

【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500 μg/mL G418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）,对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异（P>0.05）,表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF +/BLG -基因打靶细胞株（BLG基因座定点打靶hLF基因）,但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。     

白鳍豚下世纪我们还能相见吗

近日,多家中央及地方新闻单位分别用《与白鳍豚同悲》等惊人的标题,报道了今年11月专家对长江全流域白鳍豚考察的结果。白鳍豚素有“长江中的大熊猫”的美誉。它仅存于我国长江之中,是世界上最为濒危的动物之一。由于现存数量太少和生存环境的恶劣等种种原因,专家们预言,如果不采取拯救措施,白鳍豚将在20年左右灭绝。由农业部牵头,沿江省市渔政部门和有关专家参加的1999年长江全流域白鳍豚考察历时6天,考察船沿长江左右岸进行地毯式搜索,共发现白鳍豚5头次,这个数量比去年又有下降。21世纪,我们还能看到白鳍豚追波逐浪的潇洒身姿吗?为此我们采访了两位白鳍豚研究专家——南京师范大学生命科学院博士生导师周开亚教授和博士生导师华元渝教授。     

筛选和利用海洋细菌防治玉米纹枯病试验

从江苏省南通市沿海滩涂、近海海水、海藻体内分离到了862株海洋细菌,以玉米纹枯菌为指示菌对其抑菌活性进行检测,经初筛、复筛、定量复筛,获得7株抑菌效果较好的拮抗细菌,并对筛选出的高效拮抗菌株进行室内抑菌及田间防病测定试验。结果表明,NH-8菌株的拮抗活性和防效最强,通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌。