人白介素-2基因打靶载体的构建、转染及鉴定

为研究人白介素2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBCI为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2．5kb和下游3．5kb的序列作为5’和3’同源臂,将克隆得到的人白介素2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBN153。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介紊-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶裁体pBN153成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植法制备人白介素-2基因乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

果蔬乳饼配方及加工工艺研究

乳饼是云南少数民族地区的一种传统山羊奶制品,但产品单一,工艺陈旧,难以满足更多消费者需求。为了丰富乳品市场、开发新型山羊奶制品,本研究在传统乳饼加工的基础上,选用新鲜山羊奶和果蔬汁为原料。采用正交和单因素对比试验筛选果蔬乳饼配方以及加工工艺,结果表明:(1)果蔬乳饼的工艺流程:山羊乳→过滤杀菌→加热→添加CaCl_2→添加果蔬汁→添加白醋→充分搅拌→凝乳→静置→排乳清→压榨→成品;(2)乳饼制作工艺参数:凝乳温度为80℃,CaCl_2添加量为0.025%,点酸水后的pH值为3.8;(3)黄瓜乳饼最佳配方为:羊奶80%,黄瓜汁18%g,糖2%;(4)草莓乳饼最佳配方为:羊奶80%,草莓汁20%,糖适量;西瓜乳饼最佳配方为:羊奶77%,西瓜汁23%,糖适量;(5)桑葚不适宜用于制作紫色乳饼。     

猕猴桃奶豆腐加工工艺及配方研究

开发一种新型的适合大众口味的高营养奶制品。以山羊奶为主要原料,以适量的猕猴桃汁和白砂糖等作为辅料,通过工艺改进和配方优化,加工一种新型山羊奶制品。得出猕猴桃奶豆腐的加工工艺为:原料乳(制作奶皮子后的脱脂乳)→杀菌→添加发酵剂→自然凝乳→切割→排乳清→升温搅拌→保温搅拌→静置→排乳清→切碎→压榨→成形→冷藏。配方为:鲜羊奶75%,猕猴桃汁17%,白砂糖8%,再加入少量的甜味剂和调味剂。研制的猕猴桃奶豆腐既有羊奶的乳香、猕猴桃的酸甜,同时更富于其更全面的营养物质。     

CSN1S2和CSN3基因表达量与西农萨能奶山羊产奶性状的关系

【目的】研究酪蛋白中αs2酪蛋白(CSN1S2)基因和K酪蛋白(CSN3)基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量及其与产奶性状的关系。【方法】根据山羊CSN1S2和CSN3的mRNA序列(CSN1S2:AJ289716,CSN3:EF564258)设计实时定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR法,对年均产奶量不同的3组西农萨能奶山羊进行mRNA转录水平上的相对定量分析,并测定乳脂和乳蛋白的含量,同时对扩增出的mRNA片段进行克隆测序。【结果】CSN1S2基因在第1组15只西农萨能奶山羊(年均产奶量为(1 100.00±15.00)kg)乳腺组织中的相对表达量是第2组15只奶山羊(年均产奶量为(600.00±12.00)kg)的2.47倍,二者差异极显著(P0.01);CSN3基因在第1组西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量是第2组的3.10倍,二者差异极显著(P0.01);测序后进行序列比对发现,目的mRNA片段与山羊CSN1S2和CSN3基因的同源性均为100%;CSN1S2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量与乳汁中蛋白质含量相关性不显著,与脂肪含量呈显著负相关;CSN3基因的表达量与乳汁中蛋白质含量呈显著正相关,与脂肪含量相关性不显著。【结论】CSN1S2基因和CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺中的表达量对乳蛋白和产奶量有显著影响(P0.05),可作为西农萨能奶山羊产奶性状选育的候选基因。     

红枣山羊乳乳扇配方及加工工艺研究

本研究建立了红枣山羊乳乳扇的加工工艺,并对其配方及加工的工艺参数进行了优化。结果表明:(1)红枣山羊乳乳扇的加工工艺:加入食用白醋→加热至65℃→加入灭菌山羊乳→迅速搅拌→形成絮状凝乳→揉搓成团→洗涤→加入白砂糖、大枣粉→混合均匀→制成饼状→入模成型→自然干燥24～48 h→成品。(2)红枣山羊乳乳扇的配方为:食用白醋使用量占鲜羊乳的12%,大枣粉、白砂糖质量分别占凝乳块的10%,5%。     

组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。     

无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达

为了实现人白血病抑制因子基因(hLIF)在奶山羊乳腺上皮细胞中的稳定表达,本实验利用条件重组元件LoxP序列、山羊β-酪蛋白5'和3'同源臂、正负向筛选标记基因和hLIF基因构建hLIF基因打靶载体。脂质体法转染奶山羊(capra hircus)乳腺上皮细胞,进行遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)筛选获得同源重组的阳性克隆,并通过PCR、实时定量PCR和Western blot检测阳性克隆中hLIF基因的表达情况。酶切和测序分析结果显示,实验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。阳性克隆经PCR、实时定量PCR和Western blot均检测到了目的条带。表明打靶载体pLoxP-NT53L已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊生产提供了打靶载体。     

FMDV2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达.克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EGFP基因的表达.重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白.结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达.     

西农莎能奶山羊和布尔山羊GnRH基因多态性与产羔数的相关分析

根据牛GnRH基N序列设计4对引物,采用PCR—SSCP技术检测GnRH基因的多态性,同时用最小二乘法研究了其多态性与产羔数和生长体质量的关系。所研究的西农莎能奶山羊和布尔山羊群体在P4扩增片段存在多态性,分别定义为CC、CT和TT3种基因型;P1、P2和P3扩增片段均不存在多态性,只表现一种带型。通过测序发现CC型与GG型相比扩增片段的第185、336bp处同时有C—T的单碱基突变。在西农莎能奶山羊和布尔山羊群体中,CC和CT基因型产羔数最小二乘均值均极显著或显著高于TT基因型（P〈0．05）。研究结果表明,GnRH基因对西农莎能奶山羊和布尔山羊的产羔数均有显著影响,因此认为GnRH基因P4扩增位点的突变可作为西农莎能奶山羊和布尔山羊多胎性状的有效分子标记。