沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。     

强致病性沙门菌快速分子诊断技术的建立

在已有工作的基础上,利用多重PCR技术进行沙门菌组氨酸转运操纵子hisJ基因、毒力质粒spvR基因和H1抗原fliC基因的特异性扩增,结果发现,5株(鼠伤寒、猪霍乱、都柏林、肠炎、雏沙门菌)常见强致病性沙门菌标准菌株均可检测出hisJ基因(359 bp)和spvR基因(789 bp),并可检测出fliC-c基因(623 bp)或,fliC-i基因(537bp);伤寒沙门菌和亚利桑那沙门菌标准菌株检测出spvR基因,验证了伤寒沙门菌、亚利桑那沙门菌已具毒力质粒的报道,揭示它们对人和动物具强致病性.该技术有助于快速诊断强致病性沙门菌,有助于发现新的强致病性沙门菌,并为亚利桑那沙门菌以及常见具H1-c、H1-i抗原沙门菌的血清型鉴定提供辅助依据,可应用于公共卫生、食品卫生和口岸检疫等领域.     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

沙门菌fimA-LAMP快速检测方法的建立及其应用

研究针对沙门菌保守菌毛fim A基因,设计4条两对特异性引物,建立快速检测沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,并对反应温度、检测特异性和灵敏度等反应条件进行一系列优化,与常规PCR进行比较,及对临床样品进行检测。结果显示:LAMP方法最适反应温度为64℃,Mg~(2+)浓度为8 mmol/L,d NTPs浓度为0.8 mmol/L,内外引物浓度比为1∶8;对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅沙门菌扩增阳性;对沙门菌检测的灵敏度为8.6×101cfu/m L,比PCR灵敏10倍;对市场肉类产品检测,LAMP与传统方法符合率为100%。试验表明,建立的沙门菌LAMP方法特异性强、灵敏度高、结果可视,且操作简单,无需昂贵的仪器,适合基层实验室和食品监测部门应用。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物(1对内引物、1对外引物),进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料(dNTPs)、内外引物比例、Mg~(2+)浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

沙门菌19个毒力岛标志性基因的PCR检测

建立沙门菌19个毒力岛标志性基因检测方法,了解沙门菌中毒力岛的分布情况。通过比对验证挑选出45个毒力基因作为19个毒力岛标志性基因,建立PCR检测方法,并对伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌进行分布情况研究。19个毒力岛上45个标志性基因分别在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌得到验证,PCR扩增产物与预期扩增产物一致,电泳条带典型,无非特异扩增条带及杂带出现。45个标志性基因在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌检出率分别为75.56%、75.56%、66.67%和42.22%。本研究建立的45个毒力岛标志性基因检测方法具有结果准确、简单快速、费用低廉等优点,适用于沙门菌毒力岛研究及不同来源的沙门菌致病性风险评估。     

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达100fg DNA,高于常规PCR方法100倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其他常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测。     

基于单核细胞增生李斯特菌actA基因的环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

单核细胞增生李斯特菌(Lm)是主要的食源性致病菌之一,也是一种重要的人畜共患病原菌,感染人和动物后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症等.为建立快速检测Lm的方法,本研究以Lm毒力因子actA作为特异性检测的靶基因,通过条件优化初步建立了快速检测食源性Lm的环介导等温扩增(LAMP)方法.并采用该方法进行了特异性、...     

沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。     

生鲜乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物,建立了金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)方法,进行了特异性和灵敏性试验,并对临床乳样进行初步检测。结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应,灵敏度为10CFU/mL。分别用传统分离鉴定法与LAMP法对50个乳腺炎乳样进行检测,传统方法分离得到S.aureus 14株,LAMP法检测得到S.aureus 14株,符合率100%,阳性检出率均为28%。结果表明,成功建立了生鲜乳中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,该方法无需特殊的仪器,有利于在临床和基层进行推广。     

3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157 ∶ H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法.针对大肠杆菌O157 ∶ H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行...     

鸡源致病性沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测方法,设计3对特异性引物,第1对扩增沙门菌属特异性毒力基因invA 285bp片段,第2对引物扩增沙门菌鸡宿主特异性基因fliC 600bp片段,第3对引物扩增沙门菌质粒毒力基因spvR 507bp片段,经过对反应条件的优化,建立了检测鸡源致病性沙门菌的多重PCR方法。该方法可以特异扩增携带毒力质粒的致病性鸡沙门菌,而与大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾志贺菌及普通变形杆菌均无交叉反应;对沙门菌菌液的检出下限为4.5×102 CFU/mL,对重组质粒标准品的检出下限为1.67×103拷贝/μL。应用所建立的方法对采集的223份临床疑似病料进行检测,结果检出invA基因阳性27份,占12.11%,其中invA+spvR基因阳性19份,占8.52%;invA+fliC基因阳性2份,占0.89%;invA+spvR+fliC基因阳性6份,占2.69%。表明所建立的多重PCR可用于鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测及流行病学调查。     

生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌环介导等温扩增技术的建立与应用

为了快速检测生鲜牛乳中的产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC),防止食源性产肠毒素大肠埃希菌给人类造成的危害,建立快速检测不耐热型产肠毒素大肠埃希菌的环介导等温扩增方法(LAMP)。敏感性和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,特异性强,能够从生鲜牛乳中检测到1pg产肠毒素大肠埃希菌DNA,与其他型大肠埃希菌及细菌不发生交叉反应。利用建立的LAMP技术对来自西宁市奶牛场及自由市场的21份生鲜牛乳样品进行检测,6份样品呈阳性,阳性检出率为28.6%,从分子水平为生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌的检测提供了一种快速、准确的手段,对保障生鲜牛乳的食品安全有重要意义。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立与应用

参照GenBank公布的鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌fimH基因序列,根据两者在第37和第544位碱基的不同,设计了一对等位基因特异性引物,建立了一种鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床样品进行了检测.结果表明,该AS-PCR的扩增产物大小为543 bp,核酸检出限为12.6 pg/μL,菌液检出限为2.3×104 cfu/mL,适用于鸡泄殖腔拭子、鲜蛋、饲料和饮水中鸡白痢沙门菌的检测.该AS-PCR检测方法具有简便、快速、特异性强、敏感度高等特点,可应用于鸡白痢沙门菌的快速检测.     

蜂房蜜蜂球菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的蜂房蜜蜂球菌(Me lissococcus p luton,MSP)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,针对蜂房蜜蜂球菌16S rRNA特异性序列设计6条特异性引物,分别对Mg2+、dNPTs、引物、甜菜碱浓度及条件进行优化,建立了欧洲蜜蜂幼虫腐臭病的LAMP检测方法,并对其特异性和灵敏性进行了检测.结果 显示,建立的LAMP检测方法具有很好的特异性,仅以蜂房蜜蜂球菌为模板可扩增出梯状条带,最低可检测到7.231×1 0拷贝/μL,是普通PCR的100倍,并且该方法快速简便、检测时间仅需0.5 h,肉眼即可观察检测结果.结果 表明,建立的LAMP检测方法可用于蜂房蜜蜂球菌的检疫,为基层快速诊断和预防该病提供了新的技术.     

水貂阿留申病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

为建立一种简便、快速、特异的水貂阿留申病毒（ADV）检测方法,根据GenBank中已登录的ADV基因组序列,选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因,设计并合成5套环介导等温扩增（LAMP）反应所需的引物,通过试验筛选出最佳引物,并进行最佳引物的特异性及敏感性试验,建立了LAMP快速检测方法。试验结果表明,该方法比普通PCR方法灵敏性高10倍,与其他的水貂源病毒不发生非特异性反应,并且具有良好的重复性。利用建立的LAMP检测方法对30份临床样品的阳性检出率为6.7%。该方法简便快速,为水貂阿留申病的检测提供了新的发展方向,有望成为简易的常规检测手段,尤其适用于基层应用。