沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。     

沙门菌fimA-LAMP快速检测方法的建立及其应用

研究针对沙门菌保守菌毛fim A基因,设计4条两对特异性引物,建立快速检测沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,并对反应温度、检测特异性和灵敏度等反应条件进行一系列优化,与常规PCR进行比较,及对临床样品进行检测。结果显示:LAMP方法最适反应温度为64℃,Mg~(2+)浓度为8 mmol/L,d NTPs浓度为0.8 mmol/L,内外引物浓度比为1∶8;对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅沙门菌扩增阳性;对沙门菌检测的灵敏度为8.6×101cfu/m L,比PCR灵敏10倍;对市场肉类产品检测,LAMP与传统方法符合率为100%。试验表明,建立的沙门菌LAMP方法特异性强、灵敏度高、结果可视,且操作简单,无需昂贵的仪器,适合基层实验室和食品监测部门应用。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条检测技术(lateral flow dipstick,LFD)联合,建立了1种可应用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的新方法。针对单核细胞增生李斯特菌的actA基因设计3对引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,进行由生物素标记的LAMP扩增反应,并利用LFD对经FITC标记探针杂交的扩增产物完成检测。优化后的LAMP反应条件为65℃反应40min,从细菌基因组DNA提取到LFD结果判断只需90min左右,比常规PCR技术缩短近2h。LAMP-LFD可特异性地检出单核细胞增生李斯特菌,对哈维弧菌等常见弧菌及嗜水气单胞菌等的检测结果为阴性。灵敏性试验表明,LAMP-LFD针对病原纯培养物的检测灵敏度为3.2×101 CFU/mL或0.64CFU/反应,是LAMP检测的10倍,常规PCR检测的100倍;针对人工污染单核细胞增生李斯特菌的原料奶样品的检测灵敏度为1.6×102 CFU/mL或3.2CFU/反应。利用本方法可从采集样品中检测到单核细胞增生李斯特菌,检测结果与传统的细菌分离培养方法结果一致。试验表明,本研究建立的LAMP-LFD技术可特异、准确地应用于单核细胞增生李斯特菌检测,而且灵敏度高、操作简单、检测成本低,有望发展成为单核细胞增生李斯特菌快速检测的有效手段。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60 min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×10~1 CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。     

LAMP技术快速检测食源性沙门菌hisJ基因方法的建立

为建立一种快速检测食源性沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,依据Gen Bank公布的沙门菌属hisJ基因序列,利用Primer Explorer软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法。选取鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及其他6种常见食源性细菌进行特异性试验,并对其灵敏性进行了评价。针对hisJ基因建立的LAMP方法,在63℃水浴1 h便可完成沙门菌的有效扩增,该方法的灵敏度达到102cfu/mL,高于PCR方法 100倍,特异性试验结果显示只有沙门菌LAMP扩增结果呈阳性。本研究建立的沙门菌hisJ基因LAMP检测方法具有较强的特异性及灵敏性,可用于食品中沙门菌的快速检测。     

聚合酶螺旋反应快速检测沙门氏杆菌方法的建立

为了建立一种快速、灵敏且特异的沙门氏杆菌快速筛选检测方法——聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR),试验针对沙门氏杆菌菌毛保守操纵子bcfD基因设计特异性扩增引物,通过优化反应温度、dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度和反应时间以确定最佳反应体系;随后选取4株沙门氏杆菌标准菌株和12株近源菌进行特异性试验;通过菌落计数法和倍比稀释法确定PSR方法的最低检测灵敏度,并与常规PCR方法进行敏感度比较;用稀释后的沙门氏杆菌纯菌液人工随机污染40份不含沙门氏杆菌的生猪肉样品,模拟并评价PSR方法在现场检测中的应用效果。结果表明:试验成功建立并优化了PSR方法,最佳反应温度为65℃、dNTPs浓度为0.3 mol/L、Mg~(2+)浓度为3.0 mmol/L、最佳反应时间为45 min;PSR方法可以特异性扩增4株沙门氏杆菌,而对其他12株近源菌的扩增结果呈阴性;经菌落计数和倍比稀释后,PSR方法的最低检出量为4×10~(1 )cfu/mL,为常规PCR方法的100倍;从40份经人工随机污染生猪肉样品中共检测出阳性样品7份,与传统培养法的检测结果一致,检出率均为17.5%。说明试验建立的PSR方法对沙门氏杆菌的检测特异性强、灵敏度高,且不需要昂贵的设备即可在短时间内实现对沙门氏杆菌属的快速检测。     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法的建立

将环介导等温扩增技术(LAMP)分别与浊度信号检测系统(turbidimeter)和荧光信号检测系统(fluorescence)相结合,建立了LAMP-浊度/荧光单核细胞增生性李斯特菌检测方法。选择单核细胞增生性李斯特菌保守毒力基因iap序列,通过环介导等温扩增引物设计在线软件设计4条特异性引物,进行反应条件的优化,并对建立的LAMP的特异性和灵敏度进行评价分析。结果表明,构建的LAMP-浊度信号检测方法优化后的扩增温度为61℃,菌液最低检测浓度为22.1 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的10倍;LAMP-荧光信号检测方法优化后的扩增温度为64℃,菌液最低检测浓度为2.21 CFU/mL,灵敏度是普通PCR扩增方法的100倍;建立的两种LAMP方法的特异性良好,其中1株单核细胞增生性李斯特菌标准菌株和1株本试验分离保存的单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阳性,8株非单核细胞增生性李斯特菌检测结果均为阴性。利用两种LAMP方法对630份肉类及其制品、人工污染样品等进行检测,检出45个LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。结果表明,建立优化的单核细胞增生性李斯特菌LAMP-浊度/荧光检测方法具有快速、特异、灵敏等特点,特别适用于基层兽医、食品及口岸一线部门对单核细胞增生性李斯特菌快速筛查工作。     

环介导等温扩增联合横向侧流试纸(LAMP-LFD)对嗜水气单胞菌快速检测方法的建立

以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测。经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min,比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。     

牛轮状病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛轮状病毒（BRV）的普通PCR、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）三种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行检测,比较三种核酸检测方法的检出结果。三种核酸检测方法中LAMP最敏感敏感,能检测到1拷贝/μL,Real-time PCR能检测到100拷贝/μL,普通PCR只能检测到1×104拷贝/μL。但结合临床样品检测表明：常规PCR方法敏感度低会造成一部分漏检,LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较三种方法后,推荐用LAMP结合real-time PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛轮状病毒的检出率。     

快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求.     

黑蜂王台病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测蜜蜂黑蜂王台病毒(BQCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的BQCV-JL1株基因序列(KP119603.1)设计了多套LAMP引物,通过引物筛选,反应体系和反应条件优化,建立了可视化LAMP方法,并且评价了该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,建立的LAMP方法在63℃下可对BQCV核酸进行高效扩增,可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为4.0×102拷贝/μL),为普通PCR的100倍。临床样品检测结果表明LAMP法检出率高于常规PCR。本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于BQCV的快速检测。     

LAMP方法快速检测实验猴粪便样品中志贺菌

为了缩短检测周期,加快通关速度,根据基因库中志贺菌属特异性基因(ipa H)的保守序列,试验设计1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了实验猴粪便中志贺菌的LAMP检测方法。对志贺菌纯培养的敏感性可达7.5×100CFU/m L,对临床样品的敏感性可达到7.5×103CFU/m L;整个检测过程仅需12 h,且不需要昂贵的实验设备;该方法对12株其他菌株无扩增反应,且试验结果可通过肉眼观察颜色变化直接判定。试验表明,LAMP方法简便、灵敏、特异,适用于实验猴粪便样品中志贺菌的快速检测。与PCR相比,LAMP方法更加适合在基层推广使用。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测迟缓爱德华菌

将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与横向流动试纸条(latera flowdipstick,LFD)联合应用,建立LAMP-LFD方法,用于迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)的快速检测。根据E.tarda外膜蛋白A(outer membrane protein A,ompA)基因的保守区设计了6套LAMP引物,并筛得1套最适引物用于后续LAMP反应。将该套引物的上游内引物5′端用生物素标记,同时在有效扩增区段内设计1条探针ompAHP,使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记,用于试纸条显色。结果表明,优化后的LAMP反应条件为63℃ 25min,LAMP-LFD对嗜水气单胞菌等致病菌检测结果均呈阴性,对病原菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/mL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。对E.tarda人工污染组织样品的灵敏度为5×10~2 CFU/mL或1.0×10~4 CFU/g。因此,LAMP-LFD可特异地检出E.tarda,且灵敏度高、操作简便、时间短、有潜力成为检测E.tarda的常规方法。     

环介导恒温扩增(LAMP)-检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu/mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

环介导恒温扩增（LAMP）——检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu／mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门菌多重PCR检测方法的建立

利用肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门菌的iroB基因设计3对引物,建立能同时检测ETEC和肠沙门菌的多重PCR方法。结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,本方法的特异性为100%、灵敏度达10~10~2CFU/mL,用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测并与生化试验比较,结果两种方法检出大肠杆菌和沙门菌的阳性符合率达100%。     

环介导等温扩增技术检测产气荚膜梭菌α毒素方法的建立及应用

建立快速检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对GenBank发布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,应用Primer explorer V5软件在线设计了LAMP引物。通过对扩增条件包括反应时间、反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度进行优化,建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法。特异性试验显示除产气荚膜梭菌外其他细菌检测结果均为阴性,灵敏度试验显示LAMP方法对该菌DNA最低检测量为10 ng/L,菌液的最低检出量为3.7×10~1 CFU/mL,分别是PCR方法的100倍和10倍。用建立的LAMP方法对牛粪便、饲料和饮水共计102份样品进行检测,产气荚膜梭菌阳性率为19.61%(20/102),与PCR检测及细菌分离鉴定结果一致,且样品增菌时间缩短2～4 h。本试验成功建立了快速、灵敏、特异、操作简便和结果可视的产气荚膜梭菌的LAMP检测方法。     

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明：建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10²～0.5×10⁶ copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。