肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。