沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析

为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0742利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,对该蛋白功能进行生物信息学分析。成功构建了pET-28a-BMEI0742原核表达载体,SDS-PAGE检测结果显示,重组蛋白的分子量约是50 ku,BMEI0742蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。本研究成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因,并成功获得了BMEI0742蛋白,该蛋白具有与布鲁氏菌自身蛋白相同的抗原性,为布鲁氏菌翻译延伸因子Tu,为进一步研究其免疫性和保护性以及在布鲁氏菌的致病机制奠定基础。     

鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定新疆某些地区鸡白痢沙门氏菌主要流行株的流行现状和耐药情况,本研究采用平板凝集试验方法对有发病史的种鸡场进行现场检测,被检的750只鸡中,发现78例疑似鸡白痢沙门氏菌感染,运用沙门氏菌鉴别培养基、组织病理学观察和PCR方法进行确诊,并进行药敏试验。结果显示,疑似的78例鸡白痢沙门氏菌中有69例符合鸡白痢沙门氏菌的生化特性和病理学特点,PCR成功扩增出invA基因,分离率为9.2%,血清型诊断为D1型;其中分离菌对万古霉素和新霉素耐药性最高,耐药率分别为100.0%和81.2%,而对头孢曲松、克拉维酸和多黏菌素的敏感率达60.0%以上。本研究为养殖户和兽医工作者在净化鸡白痢沙门氏菌及临床用药方面提供参考。