表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达口蹄疫病毒3AB基因的伪狂犬病毒载体的构建

为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。     

鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2.将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamH Ⅰ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP.脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达.     

含绿色荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒SD-01株US2基因缺失转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据Gen Bank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将PCR产物连入pGM-T载体。用BamHI和EcoR V双酶切重组载体,使US2基因缺失约130bp,将含双loxP酶切位点的EGFP完整表达盒插入BamH I和EcoR V酶切位点之间,成功构建了以US2基因为重组臂的含EGFP基因的转移质粒载体pUS2-loxP-EGFP-loxP。     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.     

含LacZ表达盒的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

根据GenBank已发表的鸭瘟病毒活疫苗C-KCE株基因组序列设计一对引物,扩增出含TK基因完整ORF的2.7 kb的片段,克隆至pMD18T simple载体。利用该片段内的两个酶切位点Xho I和EcoR V,切除TK基因内的244 bp,用T4 DNA聚合酶补平末端;pVAX1-LacZ用Nru I和Nar I双酶切,回收含LacZ表达盒的4.1 kb片段,通过平末端连接将LacZ表达盒插入到TK基因中,从而获得了转移载体pTK-LacZ,为构建重组鸭瘟病毒奠定了基础。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达

将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护.     

表达H5亚型AIV HA和NA基因重组鸡痘病毒的构建及在高母源抗体商品鸡的免疫效力试验

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体基因工程疫苗至今未能得到推广应用的主要原因,本试验使用FPV新的复制非必需区构建的载体pP12-18构建在高母源抗体商品鸡具有较高免疫力的基因工程疫苗.将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体pP12-18中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p12LSH5HANA.将p12LSH5HANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p12LSH5HANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-12LSH5HANA.通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒.经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性.用105PFU的rFPV-12LSH5HANA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体.初步的动物试验表明,该重组病毒能使经滴鼻点眼攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%.在高母源抗体的商品鸡上,rFPV-12LSH5HANA与原有载体构建的重组疫苗rF-PV-11SH5HANA的免疫效力有显著差异,保护率分别为81.4%和45.4%.结果表明,选择FPV合适的复制非必需区构建载体是提高重组FPV在高母源抗体商品鸡免疫效力的有效策略之一.     

携带Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧...     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。