表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

禽流感HA7基因DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究

为了研究禽流感HA7亚型DNA疫苗,将HA7基因插入高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA7,然后将pCAGGHA7以100μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,免疫SPF鸡后两周抗体水平达到3Log2,4周后用100 LD50的H7N1鼻腔途径进行攻击毒,发现100μg pCAGGHA7可形成8/8的免疫保护。表明禽流感DNA疫苗pCAGGH7诱导的保护性抗体免疫反应水平较高,能达到免疫保护效果。     

禽流感病毒HA基因DNA疫苗诱导鸡CD8+T细胞的动态变化

用表达禽流感病毒血凝素HA抗原的重组质粒pCAGGoptiHA5 100μg免疫SPF鸡,用流式细胞仪检测鸡体内CD8 T细胞的动态变化。一次免疫后,免疫组外周血中CD8 T淋巴细胞数目逐渐上升,并于第3周达到峰值,在二次免疫后,SPF鸡体内CD8 T细胞数量上升速率明显高于初免时上升速率,并于第二次免疫后2周达到一个峰值,攻毒后,二次免疫的SPF鸡外周血中CD8 T淋巴细胞数量略有上升,但上升幅度不大,2周时检测发现其下降幅度明显低于一次免疫组。而阴性对照组SPF鸡外周血中CD8 T淋巴细胞的数目则无明显变化,但在攻毒后其外周血中CD8 T淋巴细胞数量也呈上升趋势,但未达到免疫组的水平,并且在1周内全部死亡。结果表明,pCAGGopti-HA5 DNA疫苗质粒可诱导有效的细胞免疫应答。     

肉种鸡肿头综合征的流行调查及防制措施

2010年11月至今,在山东、江苏、河北、河南、辽宁等肉种鸡养殖密集地区发生一种以肿头为主要特征的疾病.发病特征为病鸡有明显呼吸道症状,中后期出现肿头和神经症状病例,经流行病学分析和实验室检测证明为肉种鸡肿头综合征.     

DNA疫苗制备工艺研究

以禽流感DNA疫苗pCAOH5转化大肠杆菌JM109后,利用发酵罐进行发酵培养。将菌体悬浮裂解中和后,经澄清和浓缩处理,利用阴离子交换色谱对其进行纯化。结果表明实验室规模的技术路线完全能够为质粒DNA的工业化制备奠定技术基础。     

蛋鸡血管瘤型J亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

通过临床观察、剖检、接种DF-1细胞、间接免疫荧光试验和PCR等方法,从安徽父母代种鸡场、青岛平度和沙子口某商品蛋鸡场分离到3株血管瘤型J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为AH-101、PD-101、SZK-101.采集病鸡的血液、肝脏和脾脏组织,接种DF-1细胞分离病毒,提取DNA,用P11/PJ2 ALV-J引物进行PCR扩增结果为阳性,IFA检测为阳性.用J3/J4引物扩增gp85并测序,序列分析发现,3株毒株与国内外各ALV-J的相应核苷酸相似性为91.6%～96.9%,氨基酸序列的同源性为83.4%～96.9%.系统进化分析表明,AH-101和PD-101与原型株HPRS-103的亲缘关系最近,SZK-101与美国株AF247391的亲缘关系最近.