表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

鸭瘟病毒转移质粒的构建

为了建立重组鸭瘟病毒技术,构建了鸭瘟病毒转移质粒。在对鸭瘟强毒和弱毒株TK基因进行测序分析后,将鸭瘟病毒TK-UL24DNA片段克隆于pUC18载体中,构建了质粒pTK;将PCR扩增的GFP真核表达盒插入pTK质粒的TK基因内部,获得转移载体质粒pTK-GFP。鸭瘟病毒TK-UL24测序分析表明鸭瘟强、弱毒株TK基因序列完全相同;转移载体携带Pcmv-GFP-SV40pA表达盒,测序验证其序列与源序列一致。pTK-GFP在脂质体介导下,转染鸭胚成纤维细胞和鸭肾细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。质粒转染细胞后,绿色荧光蛋白得到了有效的表达,为进一步开展重组鸭瘟病毒的研究和构建具有遗传标记的鸭瘟疫苗奠定了基础。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。     

含LacZ表达盒的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体的构建

根据GenBank已发表的鸭瘟病毒活疫苗C-KCE株基因组序列设计一对引物,扩增出含TK基因完整ORF的2.7 kb的片段,克隆至pMD18T simple载体。利用该片段内的两个酶切位点Xho I和EcoR V,切除TK基因内的244 bp,用T4 DNA聚合酶补平末端;pVAX1-LacZ用Nru I和Nar I双酶切,回收含LacZ表达盒的4.1 kb片段,通过平末端连接将LacZ表达盒插入到TK基因中,从而获得了转移载体pTK-LacZ,为构建重组鸭瘟病毒奠定了基础。     

鸭肠炎病毒us2基因转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2全基因(包含s3、us3部分基因),将扩增产物克隆入pMD18-T载体,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切连入pUC19载体,获得质粒pUC-us2.将完整的EGFP表达盒插入us2基因内BamH Ⅰ位点,得到转移载体质粒pUC-us2-EGFP.脂质体法将转移载体质粒pUC-us2-EGFP转染DEF细胞,观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得表达.     

携带Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧...     

鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体的构建

根据Gen Bank发表的鸭瘟病毒基因组序列设计1对引物,扩增出含完整TK基因及其上下游序列的长约2.0 kb片段。利用该片段5'端和3'端部分序列作为左右同源臂,其内构建有Pcmv-MCS-BGH pA及同向Psv40-lac Z-SV40 pA表达盒,同时在lacZ基因表达盒两侧设计有loxP序列,从而获得鸭瘟病毒TK基因缺失转移表达载体p DTK-lacZ。将p DTK-lacZ转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,原位染色后镜下可见多处着染蓝色的细胞,结果表明本试验构建出适用于重组鸭瘟病毒制备平台的转移表达载体。     

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列，设计、合成了1对引物，以1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板，进行：PCR扩增，扩增出预期563bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMDl8—T载体，经Amp／IPTG／X-gal平板筛选，HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定，获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定，与参考序列比较，二者同源性为99．3％。小鹩瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒：PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织(脑、肝、脾)，均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性，能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断。     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒（NDV）F48E9株融合蛋白（F）基因1700bp克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建成表达F基因的载体pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒（HVT）非必须片段载体pTK2B中，构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒体pTK3F。经限制性内切酶酶切分析，F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白的鸭肠炎病毒gE基因转移载体构建

本实验利用PCR方法扩增DEVC-KCE株gE基因片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRI、SalI位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHI位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。该转移载体有7个单一酶切位点可供外源基因插入,上下游侧翼分别为1.57Kb和1Kb。将转移载体pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建

为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT-PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM-T Easy中得到重组克隆质粒pGEM-T-VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamHⅠ、XholⅠ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM-T-2VP1,然后将双拷贝VP1基因亚克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-2VP1。结果表明:得到了含有目的基因的阳性克隆。说明Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因原核表达质粒构建成功。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建

为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒,试验采用RT - PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因,将其连接到克隆载体pGEM -T Easy中得到重组克隆质粒pGEM -T - VP1,阳性克隆质粒经鉴定正确后,分别用BamH Ⅰ、Xhol Ⅰ、BglⅡ进行酶切,重组后得到pGEM -T - 2VP1,然后将...     

伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

携带AIV HA基因鸭肠炎病毒转移载体的构建

为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用...     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达

用RT PCR 方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )上,得到重组质粒pcDNA VP1。根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1 基因的主要抗原位点141 位~160 位及200 位~213位的氨基酸序列,将F 片段克隆到真核表达载体pcDNA 3.1( )中,得到重组质粒pcDNA F。在脂质体介导下,重组质粒pcD NA VP1和pcDNA F转染Vero细胞。间接免疫荧光分析表明VP1 基因和F 基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒（GPV）H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEX HTb-VP3中切取GPV H1株VP3基因片段，将其亚克隆于pSY538的EcoRI位点，并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用Not I切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，亚克隆于pSY681的NotI位点，构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒.重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1).间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达.rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础.