新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D蛋白的原核表达及鉴定

为表达新Ⅰ型亚肝炎病毒(DHV-1C)的VP1和3D重组蛋白,本研究根据GenBank中的DHV-1C N株全基因序列,设计合成两对引物扩增其VP1和3D基因,构建重组表达载体并进行诱导表达.SDS-PAGE和western blot分析表明,VP1和3D重组蛋白分别在诱导3h和4h后表达量达到峰值,其大小分别为37.68 ku和65.80 ku,并且能够与抗DHV-1C阳性血清产生特异性免疫反应.     

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒.重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1).间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达.rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础.     

LT蛋白诱导小鼠脾脏IFN-γ变化规律研究

为研究大肠杆菌热敏性肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)蛋白佐剂(野生型、突变型)对免疫小鼠体内细胞因子表达水平的影响,建立了检测干扰素(IFN-γ)的荧光定量PCR方法,并检测了经LT滴鼻免疫小鼠脾脏中IFN-γmRNA的表达水平。结果表明:野生型和突变型LT蛋白免疫小鼠脾脏中IFN-γ的mRNA水平呈时间依赖性升高,而PBS对照组没有明显变化。野生型LT蛋白免疫后48 h,小鼠脾脏IFN-γmmRNA的表达量与对照组相比显著上升并达到峰值,在60 h后开始下降;突变型LTRG蛋白免疫后60 h左右,IFN-γmRNA水平达到最高峰值,72 h后开始下降。本研究表明:野生型及突变型LT蛋白免疫小鼠均能增强小鼠脾脏中IFN-γ的转录表达,产生针对抗原的非特异性免疫应答。     

猪乙脑病毒重组E基因的克隆表达及间接ELISA检测方法研究

参照已发表的猪乙脑病毒(JEV)基因组序列,设计引物,扩增出E基因,克隆到pMD19-T载体中。序列分析表明:E基因与NCBI登录的JEV毒株E基因序列同源性达到96.6%—99.7%;遗传进化分析表明:该JEV属于GIII病毒。将E基因片段亚克隆到pET32a-E,IPTG诱导表达E蛋白。Western Blot检测表明:该重组蛋白能与JEV高免血清发生非特异性反应,证明该表达产物为JEV E蛋白。以重组E蛋白为包被抗原,建立检测猪JEV抗体的间接ELISA方法,检测160份猪血清样品,与猪JEV抗体检测试剂盒进行平行性对比,结果显示二者的吻合率为92.2%,表明建立的ELISA方法具有较好的特异性,有望为临床提供一种JEV血清抗体检测方法。     

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin,LT）作为粘膜佐剂,配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响,在前期已经构建的LTR72/G192基础上,选择2、4μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量,及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗,进行雏鸡免疫试验,免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结,检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24h即升高,48 h达最高值;添加2、4μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高,其中含4μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P〈0.01）;IL-6、IFN-γ转录水平有所增强,但各组间差异不具有显著统计学意义（P〉0.05）,72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降,与NDV疫苗接种组相近。由此可见,LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答,有利于对感染病毒的清除。