马鼻肺炎双重荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用

【目的】建立快速、准确检测马疱疹病毒 1 型（EHV1）和 4 型（EHV4）的双重荧光定量 PCR 检 测方法。【方法】以 EHV1、EHV4 的全基因组序列为基础,针对糖蛋白 B（gB）基因的保守序列,分别设计 EHV1 与 EHV4 特异性引物和探针,筛选引物,优化反应条件,分型检测马疱疹病毒（EHV1、EHV4）。【结果】 检测到 EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ 和 EIAV 标准毒株,EHV1、EHV4 为阳性结果,其余病毒为阴性结果; EHV1、EHV4 DNA 模板的最低检出限为 1.47×102 copies/μL;检测 64 份临床样本,阳性检出率为 14.06%,病 毒分离证实 100% 符合。【结论】双重荧光定量 PCR 检测方法可直接应用于检测并区分 EHV1、EHV4, 并可在 短时间内获得对 EHV1/EHV4 特异性及敏感性的检测结果。     

绿肥配施减量化肥对土壤固氮菌群落的影响

为了探讨绿肥配施减量化肥对土壤固氮菌的影响,以开展八年的紫云英配施减量化肥的长期定位试验站为平台,选取不施肥(CK)、单施化肥(NPK)、紫云英配施80%化肥(MF80)、紫云英配施60%化肥(MF60)和紫云英配施40%化肥(MF40)共5个处理,于水稻分蘖期采集土样,采用荧光定量PCR和Illumina Miseq高通量测序技术,分析了不同施肥制度下土壤固氮菌nif H基因丰度和多样性的变化规律。结果表明:与单施化肥相比,翻压紫云英的减量施肥处理水稻产量与其无显著差异,从化肥用量和产量综合考虑,MF60处理是一种适宜的施肥制度。翻压绿肥处理土壤全氮明显增加;碱解氮含量(除MF60处理)与NPK处理无显著差异。翻压紫云英配施减量化肥的施肥处理(除MF40处理)土壤固氮菌丰度明显高于NPK处理,且固氮菌丰度与土壤碱解氮、硝态氮和p H呈显著正相关。翻压紫云英后土壤固氮菌Shannon指数明显低于NPK处理,各施肥处理间OTU指数差异不明显。各施肥处理的土壤固氮菌均以变形菌门为绝对优势菌门,翻压紫云英的减量施肥处理变形菌门丰度显著低于单施化肥处理。主坐标分析表明,翻压紫云英配施减量化肥的3个施肥处理与CK、NPK处理的土壤固氮菌的群落结构差异较明显。研究表明,紫云英配施减量化肥有利于提升土壤肥力和固氮菌的数量,紫云英的施用和化肥用量都是影响土壤固氮菌群落结构的重要因素。     

脊尾白虾不同发育期mtDNA拷贝数变化特征分析

为了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)在不同发育期线粒体基因组(mtDNA)拷贝数的变化特征,本研究共采集其8个时期(受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期)的DNA样品,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术,对上述各发育期单个细胞中的mtDNA拷贝数进行了测定。检测结果显示,脊尾白虾受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期的mtDNA拷贝数的均值分别为2366、2648、2644、2873、3559、9948、6452和8872。进一步统计分析结果显示,mtDNA拷贝数与发育时间存在正相关性,相关系数为0.83。研究表明,随着脊尾白虾不断生长,其单个细胞中mtDNA拷贝数总体呈上升趋势。     

葡萄PP2C家族基因的鉴定与表达分析

参考拟南芥（Arabidopsis thaliana）的PP2C基因注册序列,从葡萄（Vitis vinifera）全基因组中鉴定得到PP2C家族基因27个,分为10个亚族A、C ~ I、K、L。编码氨基酸181 ~ 1 084个,理论等电点4.46 ~ 8.98。亚细胞定位分析表明,葡萄PP2C基因家族主要在细胞质、叶绿体和细胞核中表达。二级结构主要以α–螺旋和不规则卷曲为主。葡萄PP2C基因芯片表达谱分析发现,该家族成员在葡萄不同组织中响应不同的逆境胁迫。qRT-PCR分析表明,葡萄试管苗在100和50 mmol ? L-1 ABA、10% NaCl和10% PEG单独处理6 h后VvPP2C02的诱导表达量最高,分别是对照的11倍、8倍、14倍和13倍。     

朱顶红实时荧光定量PCR中不同组织器官内参基因的筛选

以朱顶红（Hippeastrum vittatum）不同组织器官为试验材料,通过实时荧光定量PCR技术检测肌动蛋白基因（ACT）、亲环蛋白基因（CYP）、转录延伸因子基因（EF-1α）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因（GAPDH、GAPDH2）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）这7个常用的看家基因的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1α和GAPDH2的表达水平较高,而且相对稳定;其次为TUB、TUA和GAPDH。geNorm和NormFinder软件分析结果显示,在不同组织器官中CYP和GAPDH2的表达稳定性最高,其次是EF-1α;进一步分析表明,CYP的表达稳定性虽然较高,但是其表达丰度较低,故不适合作为内参基因。BestKeeper分析表明,EF-1α和GAPDH2在不同组织器官中的表达稳定性较好。综合分析表明,EF-1α和GAPDH2在所有样品中表达量较高,稳定性较好。以筛选出来的EF-1α、GAPDH2以及EF-1α + GAPDH2作为内参基因检测朱顶红花器官调控基因PI的表达水平,结果表明,以上述两个基因及其组合为内参基因得到的PI表达模式相同,而且在花器官中的表达高于茎盘和根,基本符合PI调控花模型的机理。因此,EF-1α、GAPDH2或EF-1α + GAPDH2可作为朱顶红的内参基因进行相关基因的表达调控研究。     

玉蜀黍黑粉菌环介导等温扩增检测体系的建立及应用

 本文根据玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis )的UmPep1、UmPit2和UmSee1基因各设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出1套引物对LAMP反应体系进行3因素(Bst DNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度、内外引物浓度比)3水平的优化试验。并对优化的U. maydis LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及田间检测可行性试验。特异性试验表明,该方法能特异性检测U. maydis,而与其他病原菌的DNA没有交叉反应;灵敏度试验表明,该反应体系的最低检出限为44 fg·μL^-1 pEasy-Pep质粒DNA,制作的标准曲线可对U. maydis进行定量分析。该方法也适用于在U. maydis侵染前或侵染早期对田间样品进行检测,对现场采集的172份田间样品进行检测,其中140个样品显示为阳性。本研究所建立的LAMP体系具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在45 min内完成对田间样品的检测,是快速、定量检测U. maydis的有效手段。     

细粒棘球绦虫锌指蛋白基因的克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达分析

旨在分析并预测细粒棘球绦虫锌指蛋白(Echinococcus granulosus zinc finger peotein,Eg-ZFP)结构、功能及其在细粒棘球绦虫发育过程中的表达模式,预测其在细粒棘球绦虫防治中潜在的作用。通过对前期细粒棘球绦虫原头蚴(protoscolex,PSC)转录组高通量测序结果中Unigene进行筛选,克隆Eg-ZFP基因并进行序列分析,实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)分析Eg-ZFP在原头蚴及成虫中的表达特征,利用全量组织原位杂交(Whole mount in situ hybridization,WISH)检测该蛋白mRNA在原头蚴和成虫组织中的分布情况。结果显示,细粒棘球绦虫Eg-ZFP基因的CDS序列长852bp,具有完整的开放阅读框(852bp),编码283个氨基酸,预测表明Eg-ZFP分子质量大小及等电点为31.6ku和8.89;qPCR检测发现,Eg-ZFP在原头蚴及成虫阶段均有表达,且在成虫阶段表达量高;全量组织原位杂交检测结果表明,Eg-ZFP mRNA在原头蚴及成虫中分布广泛,且在成虫的生殖系统中丰度较高,提示Eg-ZFP与虫体生殖发育有关。结果表明Eg-ZFP在细粒棘球绦虫发育过程中具有重要作用,为进一步研究Eg-ZFP在E.granulosus防治中的作用奠定基础。     

红肉蜜柚 PDR 型转运蛋白基因的发掘及 CmPDR11-2 表达与耐草甘膦初步分析

基于红肉蜜柚 RNA-seq 数据库,筛选出 50 个 ABC 转运蛋白家族基因,其中包含 11 条 PDR 型基因。对11 条柚 PDR 基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2 编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的 AtPDR11 基因同源性最高,达 69.25%,利用 RT-PCR 技术克隆得到 CmPDR11-2 的 ORF 序列。该序列长度为 4 371 bp,编码一个含有 1 456 个氨基酸的蛋白质,分子量 165.138 03 ku,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有 12 个跨膜结构,定位于细胞膜。实时荧光定量 PCR 结果表明,草甘膦除草剂胁迫处理条件下,1~15 d 处理组柚叶的 CmPDR11-2 基因相对表达量呈整体上升趋势,且均高于对照组,反应迅速且持久,这表明 CmPDR11-2 基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。     

云南省玉溪市玉米致死性坏死病毒原的分子鉴定

玉米致死性坏死病是由玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)和一种或多种马铃薯Y病毒科病毒复合侵染引起的。2014年1月在对云南省玉溪市玉米病毒病害的调查中发现了一些表现严重花叶、矮化叶片甚至整个植株坏死症状的玉米。对采集样品进行RT-PCR检测,所有样品中都同时检测到了MCMV和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV),在一个样品中同时检测到了MCMV、SCMV和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus)。     

一种高效的苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法

为建立一种检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ACLSV外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和Taq Man探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为阳性标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为100拷贝/μL,比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于0.84%。表明Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏性高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。