细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性分析

 【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物,经蛋白酶K消化,离心上清作为粗提表膜糖抗原,SDS-PAGE鉴定糖抗原成分,硫酸-蒽酮法测定多糖浓度,ELISA、Western- blot 和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现,表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解;制备的糖抗原浓度为2.54mg•mL-1,初步确定为糖抗原。ELISA结果显示,随着免疫次数增加,抗血清中特异性抗体(IgG 、IgM 和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比,IgG 、IgM 和IgA的P/N值分别为4.9、3.2和6.4。未检测到特异性IgE。Wenstern-blot检测结果显示,抗血清与原头蚴粗提虫体蛋白、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白、表膜糖抗原有效识别。IFA显色结果显示糖抗原在细粒棘球绦虫虫体表膜中有表达。【结论】经蛋白酶K消化后提取的细粒棘球绦虫表膜糖抗原具有良好的的免疫原性和免疫反应性,有望用于包虫病的诊断和免疫。     

细粒棘球绦虫表膜糖抗原HSP70基因的克隆、表达及免疫特性分析

[目的]克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70 (HSP70)基因,构建原核表达载体,鉴定EgHSP70蛋白的免疫学特性.[方法]以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆EgHSP70.构建EgHSP70基因的原核表达载体pET28a-EgHSP70,诱导表达重组蛋白,纯化,免疫鼠,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测血清抗体效价、特异性及抗原在虫体组织中的位置.[结果]从Eg成虫cDNA文库中筛选获得特异性EgHSP70基因,酶切和测序结果均表明该基因已克隆到pET28a.EgHSP70融合蛋白在A600=0.6,0.4 mmol IPTG,37℃表达5h为最佳表达.经His亲和层析法纯化获得了HSP70融合蛋白相对分子质量约为33 kDa.免疫小鼠可产生高滴度(最高1∶640000)特异性抗体.Westernblot分析结果表明,制备的抗血清与EgHSP70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、Eg虫体蛋白和Eg虫体表面蛋白均能特异性结合,其他带科绦虫有此蛋白表达IFA检测结果证实EgHSP70在细粒棘球绦虫成虫体表膜及体表内有表达.[结论]实验得到的EgHSP70融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,可用于研制包虫病疫苗及相关诊断试剂为包虫病的防控提供技术支持.     

ELISA法观察小鼠感染细粒棘球绦虫的抗体变化

在ELISA法作用之下应用高纯度细粒棘球绦虫六钩蚴抗原、以及囊液抗原,分别针对一次感染、以及二次感染细粒棘球绦虫六钩蚴小鼠血清进行测定,用ELISA法对所测定结果详细分析。对模型小鼠原发性感染细粒棘球绦虫后,特异性抗体的变化规律展开分析与研究。     

重组CE18蛋白在绵羊绦虫蚴病诊断上的应用

 【目的】探讨细粒棘球蚴CE18重组蛋白作为绦虫蚴病免疫诊断抗原的应用价值,为筛选绦虫蚴病血清学诊断抗原提供依据。【方法】应用棘球蚴CE18重组抗原建立间接ELISA方法,分别对18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、19份棘球蚴感染绵羊血清及194份棘球蚴病疫区绵羊血清和13份健康羊血清进行检测,通过显著性差异分析评价CE18蛋白作为诊断抗原的意义。同时,应用生物学软件对CE18抗原蛋白同源序列进行分析,进一步从分子水平上提示CE18蛋白作为绦虫蚴病诊断抗原的依据。【结果】序列分析表明棘球蚴CE18蛋白基因为多种绦虫如泡状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫等的共有序列,其蛋白质氨基酸序列相似性很高,不同种属之间高达99%,从分子水平上表明CE18蛋白为带绦虫蚴共同抗原成分之一。重组抗原CE18-ELISA方法检测绵羊血清抗体水平显示：脑多头蚴病、细颈囊尾蚴病、棘球蚴病和棘球蚴病疫区血清的阳性率分别为38.89%、73.33%、100%和76.14%,而对照组血清为阴性反应。【结论】CE18重组蛋白可作为绵羊棘球蚴病和细颈囊尾蚴病血清学诊断抗原,用于畜群活体检疫初筛试验。     

绵羊肝包虫病的诊治

包虫病,也称棘球蚴病,俗称肝包虫病。棘球蚴病是由细粒棘球（Echinococcusgranulosus）的中绦期一棘球蚴（Echinococcus）寄生在哺乳动物脏器内所引起的疾病,细粒棘球绦虫也属带科．它的中绦期对人、畜的危害极为严重。棘球蚴可寄生于人、畜任何部位,因为体积大,生长力强,不但使周围组织受到高度压力而萎缩,也易产生继发性感染;如果蚴体破裂,后果尤为严重。     

羊棘球蚴病和绦虫病的分析诊断和防治方案

<正>1羊棘球蚴病1.1病原和流行棘球蚴主要寄生于羊的肝和肺,脑、心、脾、肾等脏器也可寄生。其成虫为细粒棘球绦虫,很小(长仅2～7 mm),在犬和其他肉食动物的小肠中多见。羊棘球蚴病主要流行于我国的西北、西南地区,对养羊业危害大。1.2临床表现相较于山羊,绵羊对本病更易感,死亡率很高。发病初期症状并不显著,病后期患羊表现为消瘦、行动无力,     

阿拉善右旗骆驼、羊棘球蚴病的调查

骆驼、羊的棘球蚴病（称：包虫病）是细粒棘球绦虫（Ecinococous，granulosus）的幼虫，寄生于绵羊、山羊、牛、骆驼、猪等中间宿主的肺、肝、脾等脏器而引起的一种慢性寄生虫病。在其流行区域内人也易感染，对我旗人体健康和畜牧业生产的发展造成了严重的危害。     

石渠棘球绦虫Es95基因克隆及序列分析

[目的]首次克隆获得石渠棘球绦虫Es95基因,并进行序列分析,为研究抗包虫病候选疫苗提供理论指导。[方法]从高原鼠兔肺脏包囊上获得石渠棘球绦虫原头蚴,提取全基因组,并根据NCBI上6种棘球属绦虫95基因序列设计引物,以基因组DNA为模板扩增到Es95基因,并克隆到T载体上,测序后进行序列分析。[结果]以石渠棘球绦虫全基因组DNA为模板扩增出Es95基因长为1 330 bp,序列分析含有3个外显子和2个内含子,有1个糖基化位点,N端有一信号肽序列(16个氨基酸),C端有跨膜区(23个氨基酸),亲水性低,B细胞抗原表位预测有ES95潜在抗原表位6个。[结论]ES95是一个分泌性糖蛋白,在包虫病的预防上具有重要意义。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

羊细粒棘球蚴全血金标渗滤检测方法的建立

为建立一种快速、高效的诊断家畜细粒棘球蚴病方法,提取羊细粒棘球蚴包囊的新鲜囊液,盐析囊液抗原,点样于硝酸纤维膜上,以胶体金-驴抗羊IgG和胶体金-兔抗鼠IgG为检测标记物,采用垂直流渗滤装置检测羊与人工感染细粒棘球蚴小鼠的血清和全血特异性抗体.患病羊阳性血清及全血检出率在90.91％ ～94.4％,细粒棘球蚴感染小鼠的血清及全血检出率均为100％;细粒棘球蚴阴性羊血清和全血假阳性率为4.00％～4.59％;与脑多头蚴病血清交叉反应率为28.57％(2/7).研究结果表明,细粒棘球蚴全血金标渗滤法可应用于羊棘球蚴病的诊断与检疫.     

柑橘大实蝇非典型气味受体基因的克隆、序列分析及组织表达模式

旨在探究柑橘大实蝇(Bactrocera minax)非典型气味受体(odorant receptor co-receptor,Orco)基因的分子特征和组织表达模式,通过对前期获得的柑橘大实蝇成虫转录组数据分析,利用RT-PCR技术克隆柑橘大实蝇Orco基因,并对该基因进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检...     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

大灰象甲非典型气味受体基因SvelOrco的克隆及组织表达谱分析

旨在克隆大灰象甲Sympiezomias velatus的Orco基因，明确其分子特征及其组织表达谱。通过分析成虫触角转录组数据并利用RT-PCR克隆出大灰象甲Orco基因，对大灰象甲Orco蛋白进行结构分析和系统发育分析，并采用qPCR测定Orco基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达量。克隆获得大灰象甲Orco基因并命名为SvelOrco(GenBank登录号：OM417062),其开放阅读框长1 449 bp,编码482个氨基酸。预测SvelOrco蛋白的分子质量为53.49 ku,等电点为5.66,主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，有7个跨膜结构域。系统发育分析表明大灰象甲与云杉八齿小蠹Ips typographus亲缘关系最近。qPCR结果显示：SvelOrco主要在大灰象甲成虫触角上表达，雄虫触角表达量最高，是雌虫触角表达量的1.22倍，SvelOrco在翅部也有少量表达，在头、胸、腹和足的表达量极低。     

瘤背石磺低频听力相关基因OrNXN克隆及表达分析

从瘤背石磺不同频率声音基因转录组中将有显著差异表达的基因与IMPC人类听觉感知和耳聋相关基因对比发掘出与听力相关的基因NXN。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得OrNXN基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析OrNXN在瘤背石磺不同组织、不同声音频率及不同潮汐节点的表达水平。结果显示,OrNXN基因cDNA全长为1 593 bp,开放阅读框长度为432 bp,共编码143个氨基酸,相对分子质量为15.57 ku;结构域预测分析表明,OrNXN含有Thioredoxin家族典型的硫氧还蛋白结构;多序列比对以及进化树构建结果表明,OrNXN与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明,在瘤背石磺7个组织中OrNXN在肠、神经节、性腺和腹足中均有表达,在肠中表达量最高,其次为神经节。不同声音频率刺激下,OrNXN在200和50 Hz处有差异表达,在不同潮汐节点,OrNXN表达量均不同,表达量基本与潮汐水位变化一致。研究表明,OrNXN可能在瘤背石磺参与感知潮汐节率时对潮汐发出的低频声音产生了响应。     

蜻蜓凤梨AfACO1基因的克隆及乙烯响应特性分析

观赏凤梨是一种重要的热带花卉。生产上常人工施加外源乙烯或乙烯衍生物促进凤梨科植物开花,但作用的分子机制不清楚。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料,利用转录组数据结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了乙烯生物合成过程中限速酶1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1carboxylate,ACC)氧化酶(ACC oxidase,ACO)的一个编码基因,将其命名为AfACO1。AfACO1cDNA全长732bp,编码156个氨基酸。理化性质分析表明,该蛋白分子质量为17.47ku,等电点为8.46。AfACO1蛋白有保守的抗坏血酸和辅因子亚铁离子结合位点。进化树分析结果表明,AfACO1与水稻的2个OsACO1-likes蛋白亲缘关系最近,且进一步的结构域分析表明,它们拥有相似的保守基序。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)结果表明,AfACO1在抽薹39d后的成株心叶中表达量最高,且施加外源乙烯利后,AfACO1的表达量逐渐上调。结果表明AfACO1可能是蜻蜓凤梨成熟期乙烯生物合成的关键酶之一。研究结果为解析外源乙烯调控凤梨科植物开花的机制奠定了基础。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

低温条件下日本医蛭各组织基因表达转录组测序及qPCR验证

为解析日本医蛭(Hirudo nippnica Whitman)繁殖的分子机理,研究不同温度下饲养的日本医蛭各组织基因表达差异情况。利用转录组学测序检测不同温度饲养条件下日本医蛭肌肉、环带和头部组织的基因表达情况,筛选出11个差异表达基因,并对其进行qPCR验证。qPCR结果显示一种具有去饱和酶功能的膜蛋白编码基因G6,在日本医蛭环带中的表达随温度的升高而降低,与转录测序结果一致,暗示G6基因可能为日本医蛭繁殖相关的关键基因。进一步对G6蛋白进行功能域预测,结果显示其属于一种跨膜蛋白。其他10个差异表达基因的转录组测序结果和qPCR结果基本保持一致,通过蛋白功能域预测结果显示预测出假定蛋白均含有的功能结构域;通过miRNA亲和预测,非编码RNA(G13)具有高亲和miRNAs特性。研究发现了10个潜在的功能基因和一个非编码RNA基因。     

黄野螟蜕皮激素受体基因HvEcR的鉴定及表达分析

从转录组文库筛选出具有完整ORF框的黄野螟EcR基因序列,命名为HvEcR(登录号:MH588318)。序列全长1 734 bp,包含1 638 bp长的ORF框,共编码545个氨基酸,具有EcR家族典型的保守结构域。同源比对结果表明,HvEcR氨基酸序列与三化螟(Scirpophaga incertulas)和二化螟(Chilo suppressalis)的同源性最高,分别高达96%和92%。RT-qPCR结果表明,HvEcR在成虫和5龄幼虫时表达最高,分别为对照的12倍和5.68倍。HvEcR在黄野螟幼虫不同组织间存在表达差异,在脂肪体中表达最高,为对照的4.54倍,其次在头与马氏管中也有较高表达,分别为对照的2.85倍和2.49倍。在20E胁迫下,HvEcR表达量均高于对照,表明HvEcR作为蜕皮激素的核受体基因,其表达可能受20E诱导。     

长白和蓝塘猪印记基因 IGF2 和 H19 的时空表达研究

运用实时荧光定量PCR技术,检测 IGF2和H19 印记基因在长白猪和蓝塘猪中的表达水平.测定了1日龄和180日龄2个阶段的基因在各组织中的转录表达水平,按照生长性状分组,对组间的表达差异进行了比较分析.分析不同日龄长白、蓝塘猪各组织中 IGF2、H19 的表达量.结果显示,仔猪初生体质量大的组肝脏组织中 IGF2 基因表达水平显著高于初生体质量轻的组;180日龄猪皮脂厚的组脂肪组织的 IGF2 基因表达量高于皮脂薄的组;1日龄仔猪肝脏、肌肉和胃组织中 IGF2 表达量高于其他测定组织和180日龄的各组织;180日龄蓝塘猪肾脏组织中的 H19 表达量显著升高.     

草鱼胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1基因的全长cDNA克隆及表达

克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus）胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP-1)基因的全长cDNA,并对草鱼不同时期的胚胎和成鱼不同组织进行了RT-PCR分析,以探索草鱼IGFBP-1基因的生物学功能。结果显示：(1)草鱼IGFBP-1基因cDNA全长为1 135 bp,包含一个789 bp阅读框,编码262个氨基酸残基;草鱼与鲤、斑马鱼、沟鲶、大鳞大麻哈鱼、虹鳟、五条、小鼠和人的IGFBP-1氨基酸序列相似度分别为94%、93%、69%、60%、58%、56%、40%和38%;草鱼IGFBP-1蛋白的N端和C端序列负责与胰岛素样生长因子(IGF)结合,其保守性较高。(2)RT-PCR分析结果表明,草鱼胚胎期IGFBP-1 mRNA的表达水平很低,在受精后4 hrs和8 hrs胚胎未能检测到转录本,受精12 hrs后,仅能检测到微量表达;草鱼IGFBP-1mRNA在肝脏、肾脏、肠和心脏组织中具有表达活性。鉴于IGFBP-1基因在IGF信号通路中的重要作用,又是一个低氧诱导基因,上述结果可为进一步探索IGFBP-1基因的功能奠定基础。