蜻蜓凤梨 AfERF113基因的克隆与表达特性

观赏凤梨是一类重要的热带花卉,但有关其生长发育调控分子机理的研究相对匮乏,这在一定程度上限制了新品种的开发和利用。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料,在分析蜻蜓凤梨转录组数据的基础上,结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列,并将其命名为AfERF113。生物信息学分析表明,AfERF113 cDNA全长1 093bp,有1个864bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码287个氨基酸。蛋白质理化性质分析表明,该蛋白分子质量为29.768 5ku,理论等电点为6.06,为一类不稳定的酸性亲水蛋白。亚细胞定位软件预测表明该蛋白定位于细胞核。结构域分析表明,该蛋白有1个保守的AP2结构域,分属ERF亚族的B-4类,与拟南芥中所有ERF蛋白的ERF113亲源关系最近。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)结果表明,AfERF113转录本在成熟株的根中表达量最高,且外源乙烯诱导后,AfERF113的表达量无论是在幼株还是在成株的各组织中均显著上调。研究结果证实,AfERF113响应了外源乙烯调控,为进一步研究AfERF113基因的功能及通过基因工程手段调控凤梨科植物生长发育提供了理论依据。     

蜻蜓凤梨AfERF109基因的克隆及响应乙烯的表达特性分析

以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料,在分析蜻蜓凤梨转录组数据的基础上,结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,简称RACE)技术克隆了APETALA2/乙烯反应元件结合蛋白(APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein,简称AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列,并将其命名为AfERF109。AfERF109基因cDNA全长939 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长762 bp,编码的蛋白含253个氨基酸残基。AfERF109分子量为28.275 1 ku,理论等电点为5.24;AfERF109不含信号肽和跨膜域,预测其定位于细胞核;AfERF109含有1个典型的AP2结构域,该结构域的二、三级结构构象保守;系统进化分析该蛋白分属ERF亚族的B-4类。实时荧光定量PCR分析表明,AfERF109转录本的表达量随着植株年龄的增长上调,在开花后的花柄中表达量最高。此外,AfERF109转录本的表达量受外源乙烯处理呈现正调控趋势。研究结果初步证实AfERF109参与乙烯调控路径,可能参与蜻蜓凤梨营养生长到生殖生长的时期转换及花柄的发育,为进一步研究AfERF109基因功能、通过基因工程手段调控蜻蜓凤梨开花提供了理论依据。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

蜻蜓凤梨AfWIN1基因的克隆及表达特性

为利用基因工程手段调控凤梨科植物生长发育奠定基础,基于转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从蜻蜓凤梨中克隆APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列AfWIN1,并通过在线软件预测其亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析其转录本表达量,且利用染色体步移方法分离其启动子序列。结果表明:AfWIN1cDNA全长995bp,含有1个501bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码166个氨基酸残基;AfWIN1定位于细胞核的碱性亲水蛋白;AfWIN1的转录本表达量随着植株年龄的增长逐渐上调,但在花器官中表达量很低甚至检测不到;AfWIN1基因5′端上游的调控序列中包含较多响应激素的顺式元件;AfWIN1在幼株和成株心叶中对乙烯响应的方式不尽相同,可能参与蜻蜓凤梨营养生长过程,但不调控花器官发育。     

芸芥果胶酸裂解酶基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从芸芥自交亲和系花药中克隆出果胶酸裂解酶(Pectate lyases,PL)基因,全长1 657bp,其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1 371bp,编码456个氨基酸,分子质量51.179ku,等电点9.42。序列比对结果表明,该蛋白与其他植物的PL蛋白具有较高的同源性,因此命名为EsPL。进化树分析表明,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜、白菜型油菜的PL基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,EsPL在芸芥开花后自交亲和系花药中的表达量显著高于自交不亲和系花药中表达量,该基因可能在芸芥自交亲和性状调控过程中发挥重要作用。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析

旨在克隆合作猪干扰素ε(Interferon epsilon,IFN-ε)基因,并对其结构和编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步研究合作猪IFN-ε生物学功能提供参考。根据GenBank上公布的猪IFN-ε基因序列(登录号:NM_001105310.1)设计引物,PCR扩增及测序获得合作猪IFN-ε基因完整编码区序列(Coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学分析。结果显示,合作猪IFN-ε基因编码区长582bp,编码193个氨基酸。该基因编码区序列与杜洛克猪、人、小鼠、黑猩猩、狗、瘤牛、蒙古野马、山羊和绵羊的同源性分别为98.4%、77.7%、56.8%、78.2%、76.5%、87.0%、85.5%、85.0%和86.0%;系统进化树结果表明,合作猪与瘤牛、蒙古野马、绵羊、山羊亲缘关系较近。此外,在合作猪IFN-ε基因CDS上共发现3个碱基突变,均为错义突变。氨基酸序列分析表明,合作猪IFN-ε蛋白分子式为C_(1027)H_(1630)N_(278)O_(290)S_(10),理论分子质量为22.83ku,等电点(pI)为8.43,属于碱性蛋白;平均亲水系数为-0.240,属于亲水蛋白质;IFN-ε蛋白无跨膜结构,存在信号肽序列,属于分泌型蛋白;IFN-ε蛋白只包含1个超家族保守结构域,即IFab结构域。二级结构分析表明,该蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链所占比例分别为61.66%、30.05%、3.11%和5.18%。     

紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶基因的克隆和结构分析

该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐(Amorpha fruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)的cDNA全长序列,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程.所获得的全长4CLA cDNA,有1 911个碱基,包含一个完整的阅读框架,编码540个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明4CLA 是典型的4CL蛋白,含有预计的AMP-binding 位点,接触反应区和保守的Cys.     

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

六出花瓶插过程中乙烯代谢特征及其调控效应

为了探究六出花瓶插过程中乙烯代谢特征及其调控效应,为六出花切花保鲜剂的研发提供理论依据,以花苞期的六出花切花为供试材料,在基础瓶插液( 1 %蔗糖 + 200 mg·L^-1 8-羟基喹啉)中分别加入20 mg·L^-1乙烯利(ETH)、4 mg·L^-1纳米银(NS)、75 mg·L^-1水杨酸(SA)和10 mg·L^-1精胺(SP)配制瓶插液处理六出花切花,分析瓶插过程中切花形态、生理和基因表达3个层面的指标变化。结果表明：（1）含有乙烯利的瓶插液处理显著缩短了六出花切花瓶插寿命,含有纳米银、水杨酸、精胺的瓶插液处理均能延长六出花切花瓶插寿命,其中以含有4 mg·L^-1纳米银的瓶插液处理效果最佳,延长了瓶插期 2 d。（2）含有乙烯利的瓶插液处理显著加速了花枝鲜样质量和花瓣可溶性糖、可溶性蛋白含量的降低,增加了花瓣丙二醛含量和相对电导率,显著提高了花瓣乙烯代谢水平。含有纳米银、水杨酸、精胺的瓶插液处理六出花切花均不同程度地延缓了花枝鲜样质量和花瓣可溶性糖、可溶性蛋白含量的降低,抑制了丙二醛含量和相对电导率的升高,降低了乙烯代谢水平。（3）含有乙烯利的瓶插液处理增加了开花各时期乙烯合成及信号转导关键基因（AlACO、AlACS、AlCTR1、AlERS1和AlEIN3）的表达量;纳米银、水杨酸和精胺均能不同程度地抑制乙烯合成及信号转导关键基因的表达。研究结果显示六出花为乙烯末期上升型花卉,外源施加乙烯抑制剂可以延缓六出花切花衰老,提高瓶插品质,其中以4 mg·L^-1的纳米银效果最佳。     

外源乙烯利对禾谷炭疽菌生物学特性的影响及转BtACO基因植物的抗病性评价

为明确乙烯对禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)致病性的影响并评价转BtACO基因拟南芥对禾谷炭疽菌的抗性.通过施加不同浓度外源乙烯利,对禾谷炭疽菌生长状况进行比较,并对喷施不同浓度乙烯利处理的野生拟南芥接种禾谷炭疽菌,分析禾谷炭疽菌的致病性,最后对转BtACO基因拟南芥接菌后的抗病性进行...     

不同激素处理对火鹤品质的影响

对火鹤进行了不同激素处理,研究不同激素类型对其株高、叶片、佛焰苞等相关指标的影响,旨在探索出适宜提高火鹤高品质的激素类型。试验结果表明：不同激素处理对火鹤株高、叶片、佛焰苞和开花数量有一定的影响,其中GA₃处理对提高火鹤观赏品质的效果较好,可明显促进开花,增加火鹤开花数,并促进株高、叶片及花葶生长;KT和ZT的处理效果次之,而B9和乙烯利处理对火鹤株高、佛焰苞等生长有一定的抑制作用。     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

续随子ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表达特性

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的关键酶和限速酶,属于酰基转移酶超家族。为探究续随子(Euphorbia lathyris L.)中二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)对于调控种子油脂合成的作用机理,依据续随子转录组数据,采用RT-PCR技术分离和鉴定出一个 DGAT1基因(命名为 ElDGAT1),运用生物信息学方法对获得的序列进行分析,通过qPCR技术研究 ElDGAT1基因在续随子不同器官中的表达特性。结果表明:从续随子中克隆获得 ElDGAT1基因的cDNA序列,编码区长为1 530 bp,共编码509个氨基酸;预测ElDGAT1蛋白定位于内质网上,且为疏水性膜结合蛋白;其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,编码的蛋白含有9个典型的跨膜螺旋区。基于DGAT1蛋白的系统发育分析表明:续随子与乌桕的亲缘关系最近,与橡胶树和木薯的同源性次之。qPCR检测结果发现, ElDGAT1基因在续随子根中表达量最低,种子中的表达量相对较高,在花后15 d、30 d、45 d的表达量呈递增趋势。研究结果为进一步分析续随子种子油脂合成积累的调控机理及 ElDGAT1 基因的生物学功能提供依据。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。