马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

野生茄转化酶抑制子基因 StINH1的克隆与序列分析

以1个受黄萎病菌诱导的“托鲁巴姆”下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄“托鲁巴姆”转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为 StINH1。该基因的开放阅读框全长531 bp,编码176个氨基酸,与电子克隆获得的序列完全相同。编码蛋白的分子质量为19.916 ku,理论等电点为5.14。序列分析表明,该基因属于植物PMEI超家族,编码的前体蛋白含有1个拥有19个氨基酸的前导肽,同时含有多个磷酸化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后, StINH1在“托鲁巴姆”根中呈下调表达。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。     

4种噬菌体对寄主青枯菌的敏感性及作用受体分析

【目的】明确不同噬菌体混合对茄劳尔氏菌(青枯菌)Ralstonia solanacearum裂解能力和对噬菌体抗性产生的影响,了解4种噬菌体的作用受体。【方法】将4种噬菌体P1556-1、P1556-2、P7-1和P1521两两混合后,比较其在青枯菌平板上产生的噬菌斑大小;噬菌体与青枯菌混合培养测定青枯菌对噬菌体的抗性;通过噬菌体与脂多糖和膜蛋白的吸附试验测定噬菌体的作用受体。【结果】噬菌体P1556-1产生的噬菌斑最大,裂解青枯菌的能力强。4种噬菌体两两混合产生的噬菌斑与单一噬菌体产生的噬菌斑大小没有显著差异,但可延缓抗噬菌体的青枯菌产生。噬菌体P1556-2可被青枯菌的脂多糖吸附,P1521能被脂多糖和膜蛋白吸附,而P1556-1和P7-1均不能与脂多糖和膜蛋白作用。【结论】不同噬菌体混合不能提高其裂解青枯菌的能力,但可以延缓抗性青枯菌的产生;不同噬菌体作用受体不同。     

赣南地区番茄青枯菌菌系多样性分析

【目的】分离鉴定赣南地区番茄青枯病菌,明确菌系分化,为当地番茄抗青枯病育种和病害防治奠定基础。【方法】从江西省赣南地区采集番茄青枯病病株,经选择性平板分离、纯化和分子鉴定,获得不同地理来源的青枯菌Ralstonia solanacearum菌株。通过生理生化测定和接种番茄试验,鉴定青枯菌的生化变种和致病类型。PCR扩增内切葡聚糖酶基因egl序列,明确青枯菌的演化型和序列变种。双层平板培养法测定其对8个不同噬菌体的敏感性。【结果】获得了来自赣南地区9个市(县)的番茄青枯菌菌株44个,其中,41个菌株为生化变种Ⅲ,3个菌株为生化变种Ⅳ;致病力测定结果聚为I、II和III类,其致病力分别为强、中和弱,其中,强致病力菌株占65.9%。所有菌株属于亚洲分支演化型(Ⅰ),并进一步划分为Sequevar13、14、15、17、18、34、44和48等8个序列变种。大部分菌株对供试的8个噬菌体敏感。【结论】赣南地区番茄青枯菌以生化变种III和强致病力菌株为主,对噬菌体较敏感,存在8个序列变种,具有明显的菌系分化现象和遗传多样性。     

番茄WD40家族SlWDR204调控植株形态建成的功能分析

作物的株高是非常重要的农艺性状,影响农作物的品质和产量.植物中WD40蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用.克隆了番茄SlWDR204基因,利用植物基因工程技术,构建植物过表达载体pBI121-35S::SlWDR204,通过农杆菌介导法获得过表达转基因植株.生物信息学分析表明该蛋白含有典型的WD40蛋白基序.定量RT-PCR分析发现在番茄各器官及果实发育不同时期该基因均有表达.观察发现SlWDR204过表达转基因植株相对于野生型植株,表现出较长的茎秆长度,表明该基因是番茄植株高度的正向调控因子.酵母双杂交文库筛选发现转录因子S1SPL3与S1WDR204具有相互作用,S1WDR204与S1SPL3可能共同调控番茄植株的茎杆发育.该研究增加了对番茄WD40蛋白参与株高调控的认知.     

克氏原螯虾泛素结合酶E2r基因的克隆及表达分析

为了解泛素结合酶E2r基因在克氏原螯虾性腺发育中的作用,利用RACE技术得到了c DNA全序列,命名为Pc-UBE2r。该基因序列全长为3 671 bp,包含泛素结合酶的特有结构域,以及半胱氨酸残基活化位点。开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,预测蛋白分子量约为27.6 ku。BLAST比对发现,克氏原螯虾UBE2r基因与节肢动物UBE2r基因具有较高的同源性。系统进化分析表明,Pc-UBE2r基因与日本囊对虾聚为一枝。qRT-PCR研究表明,Pc-UBE2r基因在性腺中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。在卵巢中,PcUBE2r基因的表达量在未发育期最低,在卵黄发生前期表达量快速增长,随后表达量逐渐降低。在精巢中,Pc-UBE2r基因的表达量在精母细胞发生期达到最高水平。组织原位杂交结果显示,Pc-UBE2r基因在卵巢中均匀分布在未发育期的卵母细胞细胞质中,随后逐渐迁移到卵母细胞细胞核以及滤泡细胞周围。在精巢中,Pc-UBE2r基因主要分布在精母细胞的周围。组织总蛋白Western blot检测发现,UBE2r蛋白在精巢和卵巢中的表达量也显著高于其他组织(P0.05)。综上所述,我们推测Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾配子发生和性腺发育方面发挥了重要作用,本研究将为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

瘤背石磺低频听力相关基因OrNXN克隆及表达分析

从瘤背石磺不同频率声音基因转录组中将有显著差异表达的基因与IMPC人类听觉感知和耳聋相关基因对比发掘出与听力相关的基因NXN。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得OrNXN基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析OrNXN在瘤背石磺不同组织、不同声音频率及不同潮汐节点的表达水平。结果显示,OrNXN基因cDNA全长为1 593 bp,开放阅读框长度为432 bp,共编码143个氨基酸,相对分子质量为15.57 ku;结构域预测分析表明,OrNXN含有Thioredoxin家族典型的硫氧还蛋白结构;多序列比对以及进化树构建结果表明,OrNXN与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明,在瘤背石磺7个组织中OrNXN在肠、神经节、性腺和腹足中均有表达,在肠中表达量最高,其次为神经节。不同声音频率刺激下,OrNXN在200和50 Hz处有差异表达,在不同潮汐节点,OrNXN表达量均不同,表达量基本与潮汐水位变化一致。研究表明,OrNXN可能在瘤背石磺参与感知潮汐节率时对潮汐发出的低频声音产生了响应。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

芸芥果胶酸裂解酶基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从芸芥自交亲和系花药中克隆出果胶酸裂解酶(Pectate lyases,PL)基因,全长1 657bp,其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1 371bp,编码456个氨基酸,分子质量51.179ku,等电点9.42。序列比对结果表明,该蛋白与其他植物的PL蛋白具有较高的同源性,因此命名为EsPL。进化树分析表明,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜、白菜型油菜的PL基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,EsPL在芸芥开花后自交亲和系花药中的表达量显著高于自交不亲和系花药中表达量,该基因可能在芸芥自交亲和性状调控过程中发挥重要作用。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

华山新麦草蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因Ph-1-SST的克隆及序列分析

蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因1-SST在植物逆境胁迫反应中起重要作用。为了挖掘华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)抗非生物胁迫关键功能基因,以华山新麦草叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆1-SST基因的全长cDNA,命名为Ph-1-SST,登录号为KX761897。通过PCR法扩增其gDNA序列,测序结果表明该基因的gDNA和cDNA序列长度分别为3 344bp和2 001bp,编码666个氨基酸残基,序列结构分析结果表明该基因含4个外显子3个内含子,预测该蛋白相对分子质量为72.9ku,理论等电点为4.87。序列比对显示,该基因与大麦1-SST基因编码蛋白的相似性最高(90%),为糖基水解酶32家族成员。对1-SST氨基酸序列的系统进化树分析显示,Ph-1-SST及其同源蛋白位于不同分支,初步推断此全长cDNA是华山新麦草中编码蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的一个新基因。结果为作物非生物胁迫改良提供重要基因资源。