小麦MYB基因的表达分析

MYB转录因子在植物生长发育和响应外界环境胁迫中发挥着重要的作用。为了分析小麦MYB基因在小麦不同组织中的表达特性,采用半定量RT-PCR方法研究了小麦MYB基因在根、茎和叶中的表达。结果表明:MYB的转录本在3个组织中均有表达,在根中MYB表达量最高,叶中表达量最低。     

水稻ISA1基因的克隆与分析

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,采用半定量RT-PCR技术分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～83.3%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

红菜薹温敏型胞质雄性不育相关基因的克隆与表达分析

根据GenBank中orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物对红菜薹温敏型(Pol)胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增,获得了红菜薹Pol胞质雄性不育特异基因orf224p和atp6p的DNA序列,红菜薹orf224p和atp6p基因与已报道的orf224和atp6基因的同源性高达100%。运用半定量RT-PCR对atp6p基因在不同器官中的表达水平进行了分析。结果表明,不育系花期叶片中该基因的表达量比蕾(长度小于0.5mm)和雄蕊中的明显低,在后2个器官中的表达量无明显差异;而在保持系的上述3个器官中的表达量无明显差异。该结果显示,atp6p基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关。     

小麦蒜氨酸酶基因TaAly1的克隆及表达特征分析

【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

小麦条锈菌转录因子PsSte12的克隆及生物学分析

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。     

牙鲆kiss2基因的分子鉴定及表达分析

为克隆与牙鲆生殖相关的神经内分泌因子kiss2基因,并检测该基因在牙鲆成体不同组织及早期不同发育阶段的表达变化,本研究采用Trizol法提取牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段样品总RNA;参照其他物种的kiss2 c DNA序列,设计并合成kiss2引物进行PCR扩增;运用实时荧光定量PCR检测kiss2基因在牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段的表达情况。结果成功地获得长度为449 bp的牙鲆kiss2 c DNA序列,其中编码区序列为366 bp,编码121个氨基酸。在该序列中发现了高度保守的"FNYNPLTLRF"序列,此序列可以调节促性腺激素释放激素和黄体生成素的合成与释放。定量PCR结果显示,牙鲆kiss2基因在脑组织中的表达量最高,在卵巢和精巢中也均有表达;牙鲆kiss2基因在胚胎阶段表达量相对较低,而在孵化后第7 d其表达量显著增高,且在孵化后的第29 d达到高峰。说明牙鲆kiss2基因具有明显的时期和组织差异性表达,其在牙鲆脑中的丰富表达及在精巢和卵巢中的表达表明该基因可能在牙鲆神经系统与生殖中发挥重要作用。     

甜瓜 ERF 转录因子基因 CmERFII-11 cDNA 克隆及表达分析

根据已报道的甜瓜Cm ERFII-11基因c DNA序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到Cm ERFII-11基因。采用相关分析软件对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光实时定量PCR进行表达分析。结果表明,所克隆的c DNA长度为954 bp,编码255个氨基酸,编码蛋白质的分子量为28.33ku,理论等电点为7.62。该基因在根、茎、叶组织以及授粉后不同时期果实中均有表达,在叶片组织中的表达量最高。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

普通小麦济麦21的LOX1基因cDNA片段克隆及分析

以普通小麦品种济麦21为材料,根据GenBank中已发表的LOX1基因序列设计引物,利用RTPCR技术获得一个小麦LOX1的基因片段,并对该片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆到的基因片段为384bp(GenBank登录号JX126806),GC含量为64.84%,推导氨基酸残基为127个,分子质量为11.15ku,等电点(pI)为4.93,与杜伦小麦、大麦、高粱、水稻的同源性分别为99.7%、94.8%、73.7%、56.2%。进化树分析表明,六倍体普通小麦LOX1基因与杜伦小麦LOX1基因(GenBank登录号HM126468)亲缘关系较近,先聚为一支,然后再与大麦的LOX1基因(GenBank登录号L35931.1)、高粱的LOX1基因(GenBank登录号GQ369443)聚为一类,最终与亲缘关系较远的水稻LOX1基因(GenBank登录号EU267789)聚类,这与物种亲缘关系的远近基本一致,表明所得LOX1基因片段可作为研究物种亲缘关系或遗传距离的参考标记之一。     

安格斯牛UCP2和UCP3基因组织表达规律研究

为了研究UCP2基因和UCP3基因在安格斯牛不同组织中的表达规律,运用实时荧光定量PCR技术检测UCP2和UCP3基因在安格斯牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌和皮下脂9种组织中的相对表达情况.结果 表明:UCP2和UCP3在所检测的组织中均有表达,且UCP2在肺脏中的相对表达量最高,极显著高于其他组织(P＜0.01),其次为脾脏和肾脏,其表达量极显著高于除肺脏外的其他组织(P＜0.01),其余组织的表达量虽有差异,差异不显著(P＞0.05);UCP3基因在皮下脂中的表达量极显著高于其他各组织(P＜0.01),其次为肾脏和肺脏,背最长肌的相对表达量极显著高于大肠、小肠、心脏、肝脏和脾脏组织(P＜0.01),其余各组织的相对表达量较低.通过对UCP2和㈣基因在安格斯牛不同组织中的表达情况进行分析,揭示这两个基因在安格斯牛不同组织中的表达差异,为进一步拓展UCP2和UCP3基因在不同组织中的功能研究提供理论支持,在某种程度上为安格斯牛的育种提供一些基础资料.     

山葡萄无色花色素双加氧酶基因（LDOX）cDNA的克隆与表达

为获得山葡萄LDOX基因的全长序列,采用RT-PCR与SMART RACE技术克隆LDOX基因,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,山葡萄LDOX基因全长1 353bp,其中开放阅读框(ORF)为1 068bp,编码355个氨基酸,氨基酸序列的分子质量为40.19ku,等电点为5.61;VAmLDOX基因(GenBank登陆号:FJ645769)属于双加氧酶基因家族,不含信号肽,VAmLDOX蛋白属于不稳定亲水蛋白,二级结构中随机卷曲含量最高;山葡萄VAmLDOX氨基酸序列与欧亚种葡萄、苹果、大豆、三花龙胆和紫苏等的同源性系数分别为99%、81%、80%、77%和75%;半定量RT-PCR分析显示,在山葡萄果实着色过程中,VAmLDOX在不同时期的果皮中均有表达,在转色期的叶片、茎、果肉中也均有表达,且表达量相近。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

瘤背石磺低频听力相关基因OrNXN克隆及表达分析

从瘤背石磺不同频率声音基因转录组中将有显著差异表达的基因与IMPC人类听觉感知和耳聋相关基因对比发掘出与听力相关的基因NXN。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得OrNXN基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析OrNXN在瘤背石磺不同组织、不同声音频率及不同潮汐节点的表达水平。结果显示,OrNXN基因cDNA全长为1 593 bp,开放阅读框长度为432 bp,共编码143个氨基酸,相对分子质量为15.57 ku;结构域预测分析表明,OrNXN含有Thioredoxin家族典型的硫氧还蛋白结构;多序列比对以及进化树构建结果表明,OrNXN与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明,在瘤背石磺7个组织中OrNXN在肠、神经节、性腺和腹足中均有表达,在肠中表达量最高,其次为神经节。不同声音频率刺激下,OrNXN在200和50 Hz处有差异表达,在不同潮汐节点,OrNXN表达量均不同,表达量基本与潮汐水位变化一致。研究表明,OrNXN可能在瘤背石磺参与感知潮汐节率时对潮汐发出的低频声音产生了响应。     

解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因，在大肠杆菌中实现异源高效表达，以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象，克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释，和已有菊酯类农药降解基因序列比对，筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因；以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板，根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，回收目的片段后与pMD19-T载体连接，筛选阳性克隆并鉴定；酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明：通过筛选得到BioH基因，该基因具有水解酶的作用，同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带，通过重组技术获得阳性克隆，PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证，重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为...     

TAPHS1基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的相关分析

TAPHS1基因是MFT-like基因,可调控小麦成熟期的籽粒休眠(影响穗发芽抗性)且与开花的发育控制相关,位于小麦3A染色体短臂上。为探究该基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的关系,设计PCR引物扩增TAPHS1基因的2个高频变异区,获得86个品种相应基因区段的DNA序列信息;以不同播期之间抽穗期相差时间为指标调查评价各品种的生殖发育稳定性。结果表明:在TAPHS1基因的高频变异区存在5种多态性,将其命名为A类、B类、C类、D类、E类;A类、B类、C类属非编码区多态性,D类及E类同时涉及编码区和非编码区多态性;D类及E类序列多态性与生殖发育稳定性相关,并根据D类序列信息开发了分子标记。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

普通小麦TaZIP29-7B基因的克隆及表达研究

金属离子在小麦生长过程中起重要作用,但土壤中金属离子含量过高,会对小麦生长造成损害。锌铁转运蛋白ZIP家族(ZRT,IRT-like protein,ZIP)广泛存在于植物中,参与多种金属离子的转运,也能提高植物的耐盐性。利用同源克隆技术获得 AtZTP29在小麦中的同源基因TaZIP29-7B,并获得其启动子序列,利用生物信息学技术对所获得的基因以及启动子序列进行初步分析,预测启动子顺式作用元件,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析小麦 TaZIP29-7B基因在根和叶中在不同金属离子溶液处理下的表达情况,以研究该基因在小麦体内中对重金属转运的作用。结果表明:序列分析显示 TaZIP29-7B基因(登录号MK203894)编码277个氨基酸,TaZIP29-7B蛋白为疏水性蛋白,定位在细胞膜上,存在信号肽,属于分泌蛋白,第89～263位置间的结构功能域ZIP,属于典型的ZIP超级家族结构域,具有8个跨膜区;进化分析显示TaZIP29-7B与单子叶植物山羊草(Aegilops tauschii)ZIP29蛋白同源性最高;启动子中存在多种响应胁迫的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,小麦 TaZIP29-7B基因在外界重金属盐的变化下表达量有所变化。说明研究结果为进一步改良小麦抗盐性提供了参考。