江西和广东烟草青枯菌对噬菌体的敏感性及聚类分析

为探索不同噬菌体对不同烟草青枯菌的侵染能力,选择从土壤中分离的6个青枯菌噬菌体,通过双层平板噬菌斑检测法,测定6个噬菌体P1521、P1553、P1556-1、P1556-2、P574-2和P7-1对江西和广东两省烟区75个烟草青枯菌的侵染和裂解情况,并基于青枯菌对3个噬菌体的敏感性差异,进一步对75个青枯菌进行聚类分析。结果表明:6个噬菌体分别可侵染65、63、61、57、57和24个烟草青枯菌菌株,噬菌体P1556-1和P1521寄主范围较广,噬菌体P1553寄主范围较窄;基于P1556-1、P574-2和P1553等3个噬菌体,对75个青枯菌进行聚类分析,将75个烟草青枯菌分为7个遗传组(Rs-I~Rs-VII),其中Rs-IV菌株数量较多,包括31个青枯菌,占供试菌株的41.33%,这些菌株对P1553噬菌体均表现不敏感,而对其它2个噬菌体敏感。     

烟草青枯病菌噬菌体分离及其生物学特性研究

【目的】烟草青枯病是我国南方烟区发生普遍而严重的细菌病害,目前尚未有理想的化学防治药剂,筛选青枯病菌噬菌体,为作物青枯病的防治提供噬菌体资源。【方法】从江西省吉安市烟田采集土壤样本,采用双层平板培养分离方法,分离青枯菌噬菌体,进一步比较物理和化学因素对噬菌体活性的影响。【结果】从吉安烟田土壤中分离获得6个青枯菌噬菌体,编号为PTb7-1、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556和PTb574,其生物学特性存在差异。结果显示,多个噬菌体的最适生长温度约为35℃,致死温度为55～60℃,适宜酸碱度为pH 5～9,且对紫外光、乙醚和氯仿敏感。然而,噬菌体PTb7-1只适合于酸性环境条件下生长繁殖,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。【结论】烟草土壤中具有丰富的青枯菌噬菌体资源,是筛选噬菌体的材料来源。6个青枯菌噬菌体生物学特性存在差异,噬菌体P2Tb1556对紫外光和乙醚不敏感,但对氯仿敏感。     

一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20 μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD₆₀₀值变化测定其对温度、pH、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1, 噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1-2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为dsDNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10-100 kD,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围（31-317 kb）;生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28-50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在pH 3-8的范围内均有较强的裂解活性,当pH值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0-9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。     

一种利用噬菌体裂解大肠杆菌Rosetta菌株菌体的方法

Escherichia coli Rosetta菌株是基因克隆表达的重要宿主菌,为了探索裂解E.coli Rosetta菌体的新方法,从污水中分离到1株能裂解E.coli Rosetta菌株的噬菌体,命名为ETP-1,并研究其生物学特性和裂解效率。结果表明,EPT-1在双层平板上形成直径为1~3 mm的噬菌斑;噬菌斑透明,周围有晕环;该噬菌体的潜伏期为20min,裂解期为70 min,在55℃以上以及p H值大于11时,噬菌体失去活性。在6 h内,噬菌体可裂解73%的E.coli Rosetta菌体,ETP-1裂解其宿主细胞为E.coli Rosetta菌株菌体的破碎提供了新的方法。     

噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

【目的】构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis,并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。【方法】全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因,构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体,电转化至乳酸菌NZ9000,经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白;用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性;利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。【结果】噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达,为1 268 bp;质量浓度1μg·mL-1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性;重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果,混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×10~9 CFU·mL~(-1)下降到约9×10~8 CFU·mL~(-1)。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功,为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。     

大肠杆菌vpr基因突变株的蛋白表达及功能研究

 【目的】进一步确定vpr基因及相关蛋白的功能。【方法】在获得vpr同源基因突变株MC1061△vpr的基础上，构建了vpr基因突变株的回复株MC1061-C，并进行了噬菌体裂解试验、细胞壁吸附试验、蛋白表达和印迹试验。【结果】亲本株MC1061和回复株MC1061-C对VT2噬菌体C43b的裂解敏感，突变株MC1061△vpr抵抗噬菌体C43 d的裂解。噬菌体吸附细胞壁试验中，吸附30 min后，亲本株和回复株的上清液中分别存在6.4％和 5.2％的游离噬菌体，吸附到90 min时未有大量的游离噬菌体释放。噬菌体与突变株的细胞壁吸附30 min后，上清液中有85.4％的游离噬菌体存在，表明VT2噬菌体能与亲本MC1061和回复株MC1061-C的细胞壁不可逆吸附，但不能与突变株MC1061△vpr的细胞壁发生不可逆吸附。在蛋白表达中，Western blot显示回复株和亲本株均能转印出特异性90 000蛋白主带，而突变株没有。【结论】vpr基因表达的分子量为90 000的Vpr蛋白与VT2噬菌体的裂解敏感性有关，可能是VT2噬菌体的裂解受体。     

致仔猪痢疾沙门氏菌特异性噬菌体的分离与纯化

【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。【结果】分离到了致病菌沙门氏菌,并得到了纯化的沙门氏菌噬菌体;经检测,该噬菌体只能裂解沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有作用。【结论】得到了纯化的可裂解沙门氏菌的特异性噬菌体。     

利用T4快速检测T4宿主型大肠杆菌初探

【目的】建立一种定量检测噬菌体宿主菌的简捷方法。【方法】按体积比1∶9将4.4×109pfu/mL的T4工作液和已知活菌浓度的T4宿主型大肠杆菌工作液混合形成模拟样品,立即在37℃150 r/min下作用5 min完成侵染,接着采用离心、微滤分离技术清除样品中直径0.22μm以下的物质(包括游离T4),同时将颗粒物(包括受侵染的大肠杆菌)截留在微滤膜中。待受侵染大肠杆菌裂解后,用SM缓冲液将子代T4从微滤膜中洗滤出来,收集滤液得到转换样品。通过噬菌斑计数法测出转换样品子代T4数量,分析其与模拟样品T4宿主型大肠杆菌活菌数量的定量关系。【结果】模拟样品T4宿主型大肠杆菌活菌数的对数和转换样品子代T4数量的对数呈一元线性关系;参试菌株和试验条件决定着方程的斜率和截距。【结论】按照上述方法转换样品,并根据转换样品子代T4数量和上述一元线性关系,可以快速测定样品中T4宿主型大肠杆菌的活菌含量。     

赣南地区番茄青枯菌菌系多样性分析

【目的】分离鉴定赣南地区番茄青枯病菌,明确菌系分化,为当地番茄抗青枯病育种和病害防治奠定基础。【方法】从江西省赣南地区采集番茄青枯病病株,经选择性平板分离、纯化和分子鉴定,获得不同地理来源的青枯菌Ralstonia solanacearum菌株。通过生理生化测定和接种番茄试验,鉴定青枯菌的生化变种和致病类型。PCR扩增内切葡聚糖酶基因egl序列,明确青枯菌的演化型和序列变种。双层平板培养法测定其对8个不同噬菌体的敏感性。【结果】获得了来自赣南地区9个市(县)的番茄青枯菌菌株44个,其中,41个菌株为生化变种Ⅲ,3个菌株为生化变种Ⅳ;致病力测定结果聚为I、II和III类,其致病力分别为强、中和弱,其中,强致病力菌株占65.9%。所有菌株属于亚洲分支演化型(Ⅰ),并进一步划分为Sequevar13、14、15、17、18、34、44和48等8个序列变种。大部分菌株对供试的8个噬菌体敏感。【结论】赣南地区番茄青枯菌以生化变种III和强致病力菌株为主,对噬菌体较敏感,存在8个序列变种,具有明显的菌系分化现象和遗传多样性。     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

噻虫嗪对褐飞虱的毒力及解毒代谢酶活性的影响

【目的】明确噻虫嗪对褐飞虱Nilaparvata lugens的抗药性及解毒代谢酶活性的影响。【方法】采用稻苗浸渍法测定褐飞虱温室种群对吡虫啉、噻虫嗪、噻嗪酮和毒死蜱的抗药性,以及对新型防控药剂氟啶虫胺腈和三氯苯嘧啶的敏感性;研究增效剂胡椒基丁醚(PBO)、马来酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)对噻虫嗪的增效作用;测定了羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450s酶活性。【结果】褐飞虱种群对噻虫嗪表现出高水平抗性,抗性倍数达到277.92倍,对氟啶虫胺腈和三氟苯嘧啶仍处于敏感水平,对三氟苯嘧啶无交互抗性。PBO对噻虫嗪的增效作用最强,增效倍数为1.99倍。温室抗性种群的细胞色素P450s活性达到4.70×10-3 IU/mg,为室内敏感品系的2.13倍。【结论】细胞色素P450s活性的增强可能是褐飞虱对噻虫嗪产生代谢抗性的主要原因。氟啶虫胺腈和三氟苯嘧啶轮换使用可有效防控褐飞虱。     

三七种子的大小对窝眼轮排种器充种性能的影响

【目的】探究窝眼轮排种器型孔尺寸与分级后三七Panax notoginseng种子的适配性对充种性能的影响规律,确定各级三七种子与适配型孔尺寸之间的关系。【方法】将三七种子分为4级,设计了4种不同型孔尺寸的窝眼轮排种器,利用离散元软件EDEM模拟各级种子在不同型孔尺寸排种器中的充种过程,分析各级种子在不同型孔尺寸排种器中的充种性能,得到各级种子适配排种器型孔尺寸,并进行了试验验证。【结果】各级三七种子均有适配型孔排种器,5.0～5.5和6.5～7.0 mm分级段的种子适配排种器型孔尺寸为7.5和8.5 mm;5.5～6.0和6.0～6.5 mm分级段的种子适配排种器型孔尺寸为8.0 mm。各分级段的种子在其适配排种器中充种时,合格指数均大于95.83%,漏播指数均低于2.00%,重播指数均低于2.17%。确定了种子长轴(l)与孔径(L)之间以及高轴(h)与孔深(H)之间的线性关系方程分别为L=0.58l+4.28和H=0.75h+3.96。【结论】排种器充种性能满足了三七播种的农艺要求,为窝眼轮排种器型孔尺寸的设计提供了理论依据。     

外源性氮和磷对火力楠和马尾松混合凋落叶分解的影响

【目的】研究外源性N和P对火力楠Michelia macclurei和马尾松Pinus massoniana凋落叶分解速率的影响,以及分解过程中的N、P、K含量变化,了解混合凋落叶分解对外源性N和P的响应机制,为森林资源管理提供参考。【方法】将火力楠和马尾松混合凋落叶置于火力楠林地及马尾松林地,分别设立4块5 m×5 m的小样方,喷施N、P和N+P,比较其分解速率及分解过程中的N、P、K含量变化。【结果】在2种林地的不同处理下,24个月后,火力楠林地混合凋落叶残留量为施N(4.99 g)对照(4.14 g)施N+P(2.17 g)施P(1.16 g),马尾松林地混合凋落叶残留量为施N(2.72 g)对照(1.21 g)施N+P(0.36 g)施P(0.16 g),施N对火力楠和马尾松林下的混合凋落叶的分解有抑制作用;施P后两者的混合凋落叶的分解速率均不同程度地有所加快;施N+P后两者的混合凋落叶的分解速率也均加快,但慢于施P处理。马尾松林下混合凋落叶残留量均小于火力楠林下混合凋落叶残留量。分解24个月后,火力楠林地施N、P和N+P的混合凋落叶N质量分数分别为13.72、12.34和13.70 g·kg~(–1),而马尾松林地分别为12.63、13.46和14.54 g·kg~(–1),均显著大于其凋落叶的初始N质量分数(9.90 g·kg~(–1));施P和N+P处理的火力楠林地混合凋落叶P质量分数由初始的0.38 g·kg~(–1)分别增至0.86和0.74 g·kg~(–1),而马尾松林地混合凋落叶P质量分数由初始的0.38 g·kg~(–1)分别增至1.37和1.05 g·kg~(–1)。凋落叶K含量的变化无规律。【结论】火力楠和马尾松混交可促进火力楠凋落叶分解,提高混合凋落叶的分解速率。     

七彩山鸡养殖场铜绿假单胞菌的耐药性、多位点序列分型及遗传进化分析

【目的】探究广东省七彩山鸡养殖场中铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的流行特点、耐药性、多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)及遗传进化背景,为临床合理用药提供参考。【方法】从广东省3个规模化七彩山鸡养殖场收集孵化死胚及周围环境样本进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,采用K-B纸片扩散法测试其对22种抗菌药物的敏感性,利用MLST分析铜绿假单胞菌分离株的分子流行特点。将各ST型的7个管家基因序列按顺序拼接,用MEGA7软件对拼接好的序列进行遗传进化分析。【结果】在采集的514份样本(死胚样本405份、环境样本109份)中共分离到铜绿假单胞菌145株(分离率28.2%),其中,24株来源于环境样本(分离率22.0%,24/109),121株来源于死胚样本(分离率29.9%,121/405)。145株铜绿假单胞菌除对氨苄西林、卡那霉素和萘啶酸天然耐药外,对复方新诺明、氯霉素和四环素的耐药性较强,耐药率分别为100%、80.0%和77.2%,其次为头孢噻肟(耐药率23.4%)。除天然耐药外,多重耐药的铜绿假单胞菌占比达73.1%(10...     

加勒比松林分改造对土壤化学性质和酶活性的影响

【目的】通过引入阔叶树种对加勒比松Pinus caribaea林进行林分改造,为科学经营加勒比松人工林提供科学依据。【方法】在一部分加勒比松林的株间和行间插种黎蒴Castanopsis fissa、大叶相思Acacia mangium、红桂木Artocarpus nitidus ssp.Lingnanensis和油茶Camellia oleifera(简称P1样地),在一部分加勒比松林的株间和行间插种荷木Schima superba、光叶山矾Symplocos lancifolia、竹节树Carallia brachiata和油茶(简称P2样地),同时,保留一块加勒比松林作为对照样地(CK)。在3个样地分别以五点取样法采集0~20和20~40 cm土层的土壤样品,用常规方法测定土壤的p H、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷和速效钾含量,分别用比色法、磷酸苯二钠比色法和高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶酶、磷酸酶及脲酶活性。【结果】3个样地0~20和20~40 cm土层的土壤有机质、全氮、土壤碱解氮和有效磷含量均为P2样地P1样地CK样地,0~20 cm土层的土壤养分含量均显著大于20~40 cm土层土壤;3个样地0~20 cm土层的土壤全磷含量均较低,全钾含量为CK样地P1样地P2样地;样地土壤的过氧化氢酶活性与p H及有机质、全氮、碱解氮、全钾和速效磷含量显著相关;磷酸酶活性与p H及有机质、全氮、碱解氮、速效磷和全钾含量显著相关;脲酶活性与土壤有机质、全氮、全磷、碱解氮、速效磷和速效钾含量显著相关。【结论】林分改造明显提高了森林的土壤肥力,且P2样地的树种组合模式优于P1样地,具有较好的土壤改造效果,可用于林分改造。     

火力楠林地土壤碳和养分储量垂直分布研究

【目的】对10年生火力楠Michelia macclurei人工林不同土层的土壤碳储量及养分储量进行研究,以了解火力楠人工林的固碳能力和土壤养分状况。【方法】在各标准地内用五点取样法,沿土壤剖面按0～20、20～40、40～60、60～80和80～100 cm分层采集土壤样品。用常规方法测定土壤pH以及有机质、全N、全P、全K、碱解N、有效P和速效K的含量,并计算土壤碳储量和养分储量。【结果】林分土壤呈酸性(pH3.54～3.79)。火力楠林地的土壤碳含量随着土壤深度的增加而下降。火力楠林地各层土壤的全P和全K含量差异不显著,全N、碱解N、有效P和速效K含量均随着土层的加深呈现下降的趋势。火力楠林地0～100 cm土壤的碳储量为259.26 t·hm~(-2),N、P和K储量分别为21.50、7.47和209.42 t·hm~(-2)。此外,随着土壤深度的增加,各层土壤的碳储量以及P、K储量总体呈现增加的趋势。【结论】火力楠林地的土壤碳储量高于全国平均水平,说明火力楠林地土壤具有较好的碳汇潜能和改良土壤的能力。深层土壤的碳储量以及P、K储量大于表层土壤,说明表层土壤的固碳能力较低且淋溶侵蚀较为严重。在今后的经营管理过程中,应注意防治水土流失,增强土壤表层的固碳能力。     

RNA-Seq定量分析盐肤木对铅胁迫的响应

为探究重金属污染地生态修复先锋植物——盐肤木对重金属胁迫的分子响应机制,设置3个铅胁迫水平(0、250、1000mg·kg~(-1)),应用Illumina HiSeq~(TM)2000进行盐肤木根系的转录组测序,并通过Gene Ontology(GO)与Pathway功能显著富集分析方法,分析说明盐肤木响应不同铅胁迫水平下的差异表达基因。结果表明,盐肤木在遭受轻度铅胁迫时,主要有4类水解酶与2类磷酸酶相关基因显著富集,说明盐肤木主要通过调节细胞内水解酶与磷酸酶相关基因来抵御胁迫,而在重度铅胁迫下,主要有6类氧化还原酶相关基因出现显著富集,此时氧化还原酶相关基因起到主要调节作用;盐肤木在铅胁迫下细胞受损,在轻、重度铅胁迫下,分别有24、16类细胞相关基因显著富集,但其自身可通过调节细胞内细胞器、细胞质等相关的细胞运动以应对逆境;核糖体代谢通路是盐肤木适应铅胁迫的主要代谢通路。研究表明,核糖体相关基因是盐肤木响应铅胁迫的主要应答与调节基因。     

大肠杆菌glyA工程菌抗噬菌体菌株选育

[目的]该研究旨在选育具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株。[方法]利用噬菌体诱发及紫外耦合噬菌体诱发筛选大肠杆菌glyA工程菌的抗噬菌体菌株。[结果]从噬菌体诱发筛选到的24株抗性菌株中筛选出了20株具有稳定抗性的抗性菌株,但其中仅有1株生长势优于原始株,酶活均低于原始株;耦合法诱导得到的41株中有39株具有较好的稳定性,其中7株生长势优于原始株,2株酶活大于原始株。[结论]利用紫外耦合噬菌体诱发筛选大肠杆菌glyA工程菌的抗噬菌体菌株能得到较好的试验效果。