莲雾实时荧光定量PCR内参基因的筛选和验证

【目的】莲雾果实品质不稳定和冬季低温寒害是生产上的两大问题,筛选稳定可靠的内参基因,以便开展莲雾品质形成和低温胁迫响应分子机制研究。【方法】以‘紫红’‘黑珍珠’‘翡翠’3个莲雾品种为材料,利用qRT-PCR检测7个候选内参基因ACT-7、GAPDH、UBQ、α-TUB、CYP20-1、EF-2和APRT-5在果实发育和低温胁迫时的表达水平,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件进行基因稳定性评价。【结果】不同软件分析结果不同,geNorm、NormFinder和RefFinder结果相似,果肉发育过程、果皮发育过程、低温胁迫下表达最稳定的内参基因分别是ACT-7、α-TUB和CYP20-1,BestKeeper则显示UBQ为表达最稳定的基因。用筛选的内参基因α-TUB和UBQ分析莲雾花青苷合成途径中F3H基因的表达,2者表达规律较一致。【结论】莲雾果肉发育过程、果皮发育过程、低温胁迫下最适的内参基因数分别为4个(ACT-7、GAPDH、UBQ、α-TUB)、2个(α-TUB、UBQ)和2个(CYP20-1、UBQ)。     

石蒜属植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

以石蒜属植物换锦花（Lycoris sprengeri）、石蒜（Lycoris radiata）和中国石蒜（Lycoris chinensis Traub）不同组织器官、不同花发育时期以及不同杂交种的幼小鳞茎为研究材料,利用qRT-PCR技术检测Actin、EF-1α、GAPDH、5S rRNA、Ubiquitin和β-Tubulin等6个内参基因的mRNA表达情况,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和Reffinder软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。结果表明,石蒜属植物种间和种内内参基因表达差异明显,在分析换锦花不同组织基因表达时可选用β-Tubulin、Actin和GAPDH作为内参基因,分析不同花期的基因表达时宜选用5S rRNA、EF-1α、Actin和β-Tubulin作内参基因。中国石蒜不同组织最合适的内参基因是5S rRNA、Ubiquitin、EF-1α和β-Tubulin,而不同花期最合适的内参基因则是Ubiquitin、β-Tubulin。分析石蒜不同组织间基因表达的适宜内参基因是β-Tubulin和5S rRNA,不同花期为Ubiquitin、β-Tubulin以及5S rRNA。不同杂交种鳞茎适宜内参基因为β-Tubulin和Actin。     

药用蒲公英低温和高温胁迫下内参基因筛选与相关基因表达分析

为研究不同温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因与温度响应相关基因的表达，分别以低温（4 ℃）和高温（38 ℃）胁迫0、3、6、12、24和48 h共12个处理的叶片为材料，选取10个候选内参基因18S、EF1α、TUB、40S、GAPDH、β-actin、ACT11、TUA、60S和SKIP，利用RT-qPCR技术以及geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价其稳定性。利用筛选出的最适内参基因对药用蒲公英12个温度响应基因（AP2/ERF、Dof、ICE1、MYB、bZIP、NTL6、HSF、Gols、HSP、NAC、XCT和WRKY）的表达水平进行定量分析。结果显示：温度胁迫下药用蒲公英最适内参基因为18S和GAPDH；药用蒲公英AP2/ERF、HSF、Glos、HSP、NAC、XCT基因在低温和高温胁迫下均为先上调后下调表达，bZIP、NTL6在温度胁迫下波动变化，Dof、ICE1、MYB在低温胁迫下先上调后下调表达，高温胁迫下持续下调表达，WRKY在高温胁迫下表达量远远高于低温胁迫。依据基因表达量推测，药用蒲公英低温和高温胁迫的响应机制存在差异，AP2/ERF、Dof主要响应低温胁迫，HSF、XCT、WRKY主要响应高温胁迫。     

山核桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

[目的]筛选出山核桃中的最佳内参基因.[方法]以山核桃的根、茎、叶、柱头、果皮、胚、不同处理下的叶片及嫁接后的砧木和接穗为试验材料,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder4种软件对10个管家基因家族(ARF、ACT1、ACT7、MPS、UBC9、CYP、60SRP、EF-1α、...     

钝裂银莲花花色素合成相关基因qRT-PCR内参基因的筛选

为了筛选适合于钝裂银莲花类黄酮/花青素合成途径中相关基因qRT-PCR表达分析时的内参基因,根据钝裂银莲花蓝/白不同花色花器官组织的转录组测序结果,选取了多聚泛素酶基因(polyubiquitin,UBQ)、微管蛋白基因(β-tubulin,β-TUB)、水通道蛋白基因(aquaporin,AQP)、肌动蛋白基因(actin,ACT)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、组蛋白基因(histone,HIS)、转录延伸因子基因(elongation factor 1-β,EF-1β)和60S核糖体蛋白基因(60S ribosomal protein L13-1,RPL13)等8个常用内参基因作为候选基因,以钝裂银莲花的叶片、茎杆和蓝/白色花器官等不同组织为试验材料,通过qRT-PCR检测这8个候选内参基因的表达情况,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件对其稳定性进行分析评价。结果表明:8个候选内参基因中,UBQ表现最稳定,而β-TUB相对稳定性最差。以最稳定的UBQ为内参对钝裂银莲花类黄酮/花青素合成途径中16个相关基因表达情况进行qRT-PCR分析,结果与前期转录组测序结果一致。UBQ为钝裂银莲花花色素合成途径相关基因表达分析的最适内参基因。     

‘砀山酥梨’实时荧光定量PCR内参基因的筛选

对'砀山酥梨'不同组织器官及不同非生物胁迫条件下叶片中可以稳定表达的内参基因进行筛选,为后续荧光定量PCR试验提供参考基因。分别对生长45 d的'砀山酥梨'嫁接苗进行低温、高温和盐胁迫处理,采集不同处理时间的叶片;还分别采集'砀山酥梨'4个果实发育时期的果肉(分别为花后32、65、99、143d)、叶片、成熟果皮、花粉、花柱共26个样品。利用实时荧光定量PCR技术对4个传统内参基因:β微管蛋白基因(TUB)、多聚泛素酶基因(UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)和转录延伸因子基因(EF1α),以及通过转录组数据筛选出来的3个新内参基因Cytochrome b561(CyB)、WD-repeat protein(WDP)和mRNA capping enzyme(mRCE),共计7个内参基因在26个样品中的表达差异情况进行测定。结果表明:通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper 3个软件对其表达稳定性进行分析,最终筛选出在不同组织及非生物胁迫条件下稳定表达的最优内参基因。UBQ在高温和盐胁迫处理的'砀山酥梨'叶片中表达最稳定,可作为优选内参基因;在低温胁迫处理下,TUB和WDP在'砀山酥梨'叶片中表达较稳定,可作优选内参基因;WDP在'砀山酥梨'不同组织器官中表达最稳定。不同内参基因在同一物种不同组织及胁迫处理条件下表达稳定性具有较大差异,在进行荧光定量PCR试验时,应根据具体的试验材料和方法选择最优内参基因。     

巨大口蘑内参基因的筛选

根据巨大口蘑(Tricholoma giganteum)转录组测序组装结果,选取6个组成型表达基因(β微管蛋白基因β-tubulin、肌动蛋白基因act、核糖体蛋白基因60S、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶基因ND、RNA聚合酶Ⅱ基因rpb2、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapdh)为候选内参基因,结合geNorm、NormFinder以及BestKeeper软件与实时荧光定量PCR技术,对巨大口蘑各候选内参基因在不同生长阶段(Ⅰ组)、不同组织(Ⅱ组)以及不同亚铁离子浓度胁迫条件下(Ⅲ组)的表达稳定性进行分析。结果表明:β-tubulin基因在供试条件下的相对表达量较稳定,可作为巨大口蘑功能基因转录水平分析的内参基因。     

组培条件下苹果实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选在组织培养条件下苹果苗中稳定表达的内参基因。【方法】应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S r RNA,GAPDH,TUB,UBQ,ACT,EF-1α六个常用植物内参基因在苹果组培苗不同基因型、不同组织、不同继代时间的m RNA表达差异情况。供试的4个苹果基因型为‘长枝富士’‘短枝富士’‘红珍珠海棠’、砧木‘A8-11’;继代培养的不同组织为茎、叶、整株,生根培养的不同组织为根、茎、叶、整株;不同继代期间为10、20、30、40、50、60、70、80 d。【结果】经Ge Norm软件对6个内参基因的表达稳定性进行评价,ACT和EF-1α在苹果组培苗的不同组织和不同继代时间的基因表达分析中较稳定,UBQ和EF-1α在苹果组培苗不同品种中表达均稳定。【结论】组培条件下,苹果基因表达相关研究的理想内参基因为ACT、UBQ和EF-1α。     

热胁迫下糙皮侧耳实时荧光定量PCR内参基因的选择

在组成型表达基因和热胁迫转录组数据中选择12个基因作为热胁迫下糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)实时荧光定量PCR的候选基因。以40℃热处理0.5、1、3、6、12、24、48 h的糙皮侧耳菌丝体为材料,采用候选基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,运用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对结果进行分析,评估12个候选基因的稳定性。结果显示β-微管蛋白基因、β-肌动蛋白基因和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因可以作为糙皮侧耳热胁迫下理想的内参基因,而丝氨酸蛋白酶基因、磷酸化酶基因和细胞周期蛋白不适合作为糙皮侧耳热胁迫下的内参基因。     

‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin 5个管家基因在不同材料中的表达情况,并结合geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT和BestKeeper 4种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明,actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚’果实发育进程中较为稳定的内参基因,而EF1-α和β-tubulin则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚’最佳的内参基因β-tubulin,为今后目的基因的表达分析奠定了基础。     

喀西茄内参基因实时荧光定量PCR表达稳定性评价

为了筛选在喀西茄（Solanum aculeatissimum）中表达稳定的内参基因,选取7个常用内参基因GAPDH、ACTIN、18sRNA、UBQ、TUA、EF1和CYP,利用实时荧光定量PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和RefFinder软件对其在喀西茄不同组织、不同植物生长调节剂处理、非生物和生物胁迫下的表达稳定性进行评价。结果表明,TUA和18sRNA在喀西茄不同组织中的表达稳定性最好,18sRNA和ACTIN在不同植物生长调节剂处理条件下表达水平最稳定,EF1和GAPDH在干旱和盐条件下表达稳定性最好,TUA和EF1在所有喀西茄测试样品组中（包括不同组织、不同植物生长调节剂处理、非生物及生物胁迫）的表达稳定性最高,而CYP和ACTIN在喀西茄不同试验条件下的表达稳定性较差。     

CYP450 epoxygenase/EET pathway attenuates adipose inflammation of obese mice through HIF-1α

AIM To investigate the effects of cytochrome P450 （CYP450） epoxygenase/epoxyeicosatrienoic acid （EET） pathway on insulin resistance in obese mice, and to explore the possible mechanisms. METHODS High-fat diet-induced obesity model was established in C57BL/6Cnc mice, and the obese mice were randomly divided into 3 groups, including obesity group （treated with saline; n=10）, EET group （treated with 11,12-EET; n=10） and EET inhibitor 14,15-epoxyeicosa-5（Z）-enoic acid （EEZE） group （n=10）. Normal C57BL/6Cnc mice （n=10） treated with saline served as control. Protein expression of CYP2J2 （one of CYP450 epoxygenases） and hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） was measured by Western blot. Vessel-like structure was detected by immunofluorescence staining. The serum levels of insulin, tumor necrosis factor-α （TNF-α）, interleukin （IL）-1β, IL-6 and monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1） were measured by ELISA. RESULTS In obese mice, homeostasis model assessment of insulin resistance （HOMA-IR） values were increased, the protein level of CYP2J2 was reduced, and the protein level of HIF-1α was increased in adipose tissues as compared with the controls （P<0.05）. The serum levels of MCP-1, IL-1β, IL-6 and TNF-α were also significantly increased in obese mice （P<0.05）. After treatment with 11, 12-EET, the HOMA-IR values were decreased compared with vehicle-treated obese mice, HIF-1α expression levels were decreased in the adipose tissue, and the serum levels of MCP-1, IL-1β, IL-6 and TNF-α were reduced （P<0.05）. Immunohistochemical results of adipose tissue from vehicle-treated obese mice showed a marked decrease in vessel-like structures （CD31-positive） compared with normal control mice （P<0.05）. EET treatment significantly increased the newly formed vessel-like structures in the visceral adipose tissues of obese mice as compared with vehicle-treated obese mice （P<0.05）. CONCLUSION High-fat diet-induced obesity and insulin resistance are closely related to the CYP450 pathway. Exogenous EETs effectively decrease obesity-induced insulin resistance possibly through pro-angiogenesis and attenuation of hypoxia and inflammation.     

苹果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

【目的】为筛选苹果实时荧光定量PCR实验中最适内参基因,【方法】应用实时荧光定量PCR技术,分析5个传统内参基因18SrRNA、ACTB、GAPDH、UBQ、TUB在苹果不同基因型、不同组织、果实不同发育时期的mRNA表达差异情况。供试的6个不同基因型苹果分别为:新疆野生苹果、八棱海棠、丽江山荆子、‘津轻’、‘国庆’、‘金冠’;6种不同组织为果皮、果肉、叶片、愈伤组织、花瓣、种子;5个果实发育不同时期为花后28、50、74、95、115 d。【结果】经geNorm程序分析发现5种内参基因的表达稳定性各异,UBQ在果实不同基因型和不同发育时期的基因表达分析中最稳定;ACTB和UBQ在6种不同组织中表达均稳定。【结论】UBQ在参试样品中表达均比较稳定,是研究苹果基因表达分析中理想的内参基因。     

黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

 以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3–磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1 011 bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2 h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12 h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4 h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。