牡丹5个管家基因的克隆及其在系统进化分析中的应用

利用RT-PCR技术从牡丹组7个野生种和1个栽培种中分别克隆得到泛素延伸蛋白基因(ubiquitin,UBI)、素环蛋白基因(cyclophilin,CYP)、肌动蛋白基因(Actin)、葡萄糖六磷酸脱氢酶基因(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)和β–微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)等5个管家基因的编码序列(coding sequence,CDS)。序列比对分析发现,5个管家基因序列均相对保守,其在牡丹7个野生种和1个栽培种中的保守性在99.04%~99.69%。利用5个管家基因分别构建了其在牡丹组8份材料中的系统进化树。5个系统进化树均将8份材料分成两组,即革质花盘亚组和肉质花盘亚组;由于5个管家基因核苷酸序列各自的保守性不同,在区分亚组成员间略有差异。综合分析5个管家基因构建的系统进化树可知,杨山牡丹(Paeonia ostii)和栽培牡丹(P.suffruticosa‘Luoyanghong’)常聚为一支,二者亲缘关系较近,因而推测杨山牡丹可能参与了栽培牡丹的形成;紫斑牡丹(P.rockii)和四川牡丹(P.decomposita)一直聚为一支,推测二者亲缘关系较近;黄牡丹(P.lutea)和紫牡丹(P.delavayi)一直聚为一支,推测这二者亲缘关系较近。狭叶牡丹(P.potaninii)与黄牡丹和紫牡丹分化较早,结合前人研究结果建议将狭叶牡丹作为一个独立的种。     

朱顶红实时荧光定量PCR中不同组织器官内参基因的筛选

以朱顶红（Hippeastrum vittatum）不同组织器官为试验材料,通过实时荧光定量PCR技术检测肌动蛋白基因（ACT）、亲环蛋白基因（CYP）、转录延伸因子基因（EF-1α）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因（GAPDH、GAPDH2）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）这7个常用的看家基因的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1α和GAPDH2的表达水平较高,而且相对稳定;其次为TUB、TUA和GAPDH。geNorm和NormFinder软件分析结果显示,在不同组织器官中CYP和GAPDH2的表达稳定性最高,其次是EF-1α;进一步分析表明,CYP的表达稳定性虽然较高,但是其表达丰度较低,故不适合作为内参基因。BestKeeper分析表明,EF-1α和GAPDH2在不同组织器官中的表达稳定性较好。综合分析表明,EF-1α和GAPDH2在所有样品中表达量较高,稳定性较好。以筛选出来的EF-1α、GAPDH2以及EF-1α + GAPDH2作为内参基因检测朱顶红花器官调控基因PI的表达水平,结果表明,以上述两个基因及其组合为内参基因得到的PI表达模式相同,而且在花器官中的表达高于茎盘和根,基本符合PI调控花模型的机理。因此,EF-1α、GAPDH2或EF-1α + GAPDH2可作为朱顶红的内参基因进行相关基因的表达调控研究。     

北京地区牡丹国庆二次开花研究初探

以北京地区常见秋发牡丹品种秋发1号为试验材料,研究了在北京地区露地人工脱叶处理、人工脱叶与赤霉素(GA(3))复合处理、人工脱叶与GA(3)和乙烯利(ETH)复合处理对牡丹秋季露地二次萌芽、开花的影响.结果表明,在北京地区二次开花以8月中旬至下旬为适宜处理时间,人工脱叶与适宜浓度GA(3)的复合处理不仅能有效打破混合芽的休眠,还能促进花蕾、花枝和叶片的发育,乙烯利等化学药剂处理可使秋发1号二次开花时间推迟,并明显促进其二次叶片的发育.在完善的花芽分化基础上,综合掌握上述人工措施,可使秋发1号于国庆节前后开放,且具有较高的观赏价值.     

牡丹泛素延伸蛋白基因ubiquitin克隆及其作为内参基因的研究

以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）为试验材料,采用RT-PCR方法获得一个牡丹泛素延伸蛋白基因Psubiquitin（PsUBI）,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为447 bp,编码148个氨基酸,GenBank登录号为KP742952。序列比对发现,该基因与其他23种植物泛素延伸蛋白核苷酸序列的相似性均在81%以上,氨基酸序列的相似性达96%。进化分析表明,牡丹泛素延伸蛋白与棉花泛素延伸蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,在牡丹不同组织器官中,相对于其他5个常用看家基因（GAPDH、GAPDH1、tubulin、tubulin2、18S rRNA）,ubiquitin的PCR扩增曲线的CT值最为恒定,尤其是在不同花器官中的CT值完全一致。进一步分析发现该基因在牡丹的根、茎、叶片、花、雄蕊和心皮组织中均恒定表达,特别是花器官中的表达量几乎完全一致。以ubiquitin作为内参基因探讨控制花器官发育的基因PsAG的表达情况,结果显示PsAG的表达模式与其作用位点相吻合,ubiquitin更适宜作为牡丹花器官研究的内参基因。     

不同浓度蔗糖及甘露醇处理对芍药切花采后品质影响的研究

本研究以芍药切花“杨妃出浴”为研究对象,分别测定了不同浓度蔗糖（10 g/L、20 g/L、50 g/L）及甘露醇（100 mM、250 mM、300 mM）处理对芍药切花花朵开放进程、开花级数及花径增大率的影响。结果表明,3个蔗糖浓度梯度对花朵开放均有一定促进作用,其中20 g/L的浓度效果最好,可作为今后配置芍药切花保鲜液的优选浓度。不同浓度的甘露醇处理均对芍药切花瓶插品质有负面影响,其中100 mM的处理浓度影响相对较小,但花朵在盛开之前也已经衰老,其余两个处理浓度直接导致了花朵无法开放。本研究结果可为今后进一步提出改善芍药切花的保鲜措施提供一定帮助。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

乙烯和1-MCP的竞争性作用对月季花器官乙烯生成量及相关基因表达的影响

 以探讨月季切花不同花器官的乙烯生物合成和对乙烯的感受为目的,以切花月季‘Samantha’为试材,进行了乙烯和1-MCP交叉处理,测定花朵各器官乙烯生成量,Rh-ACS3、Rh-ACO1和Rh-ETR3基因的表达。结果表明,1-MCP前处理或后处理均能有效抑制花瓣、雌蕊和花托中由于外源乙烯造成的内源乙烯生成量增加。在基因表达方面,Rh-ACS3、Rh-ACO1和Rh-ETR3在花瓣和雌蕊中对乙烯处理的诱导表达均可被1-MCP前处理或后处理有效抑制,而在花托中,这种抑制主要针对Rh-ETR3。这些结果说明,1-MCP对乙烯的竞争性抑制作用主要发生在花瓣、雌蕊和花托上,其竞争效果在乙烯处理前或乙烯处理后均有效。     

成花素基因PdFT的克隆及其对牡丹成花的影响

【目的】克隆紫牡丹FT同源基因,分析其表达模式以及对紫牡丹成花的调控作用。【方法】以紫牡丹为试验材料,通过RT-PCR的方法克隆紫牡丹FT同源基因PdFT。通过实时荧光定量PCR分析PdFT在紫牡丹不同组织、紫牡丹开花物候期各过程及不同处理的表达情况,并探讨PdFT与花芽发育状态的关系。同时,将克隆到的紫牡丹PdFT克隆到表达载体pET-28a上,构建融合表达载体pET-28a-PdFT,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】克隆得到包括完整开放阅读框（ORF）的PdFT cDNA序列,ORF长度为522 bp,编码173个氨基酸,GenBank登录号为KF113360。氨基酸序列比对表明：PdFT蛋白具有一个典型的PEBP结构域,属于PEBP家族;并且与GenBank中已克隆的FT同源基因具有高度的同源性。实时荧光定量PCR分析结果表明,PdFT在紫牡丹根、茎、叶、芽中均有表达,芽中表达量最高,叶中表达量最低。紫牡丹开花物候期各过程PdFT的表达分析表明,在花芽膨大期表达量最高,随着花蕾的发育,PdFT的表达量逐渐降低。PdFT在不同光照温度条件下的表达分析表明,短日照和低温处理均抑制PdFT基因的表达。不同状态花蕾中PdFT的表达分析结果表明,败育花蕾PdFT的表达量低于正常花蕾。同时,GA3及去叶处理均能提高PdFT的表达量。所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】紫牡丹PdFT与已克隆的FT同源基因高度同源,属于FT亚家族,在紫牡丹顶芽中表达量最高,可能调控牡丹开花,PdFT的克隆及表达分析为研究紫牡丹成花的分子机理奠定了基础。     

我国牡丹商品化生产存在的问题及几点建议

对我国牡丹栽培历史和现状进行了归纳,提出现在牡丹商品化生产中主要存在的问题包括自有品牌少,缺乏各自特色,并且没有统一的质量标准体系。根据这些特点,文章提出了一些解决问题的建议和看法。