牡丹5个管家基因的克隆及其在系统进化分析中的应用

利用RT-PCR技术从牡丹组7个野生种和1个栽培种中分别克隆得到泛素延伸蛋白基因(ubiquitin,UBI)、素环蛋白基因(cyclophilin,CYP)、肌动蛋白基因(Actin)、葡萄糖六磷酸脱氢酶基因(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)和β–微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)等5个管家基因的编码序列(coding sequence,CDS)。序列比对分析发现,5个管家基因序列均相对保守,其在牡丹7个野生种和1个栽培种中的保守性在99.04%~99.69%。利用5个管家基因分别构建了其在牡丹组8份材料中的系统进化树。5个系统进化树均将8份材料分成两组,即革质花盘亚组和肉质花盘亚组;由于5个管家基因核苷酸序列各自的保守性不同,在区分亚组成员间略有差异。综合分析5个管家基因构建的系统进化树可知,杨山牡丹(Paeonia ostii)和栽培牡丹(P.suffruticosa‘Luoyanghong’)常聚为一支,二者亲缘关系较近,因而推测杨山牡丹可能参与了栽培牡丹的形成;紫斑牡丹(P.rockii)和四川牡丹(P.decomposita)一直聚为一支,推测二者亲缘关系较近;黄牡丹(P.lutea)和紫牡丹(P.delavayi)一直聚为一支,推测这二者亲缘关系较近。狭叶牡丹(P.potaninii)与黄牡丹和紫牡丹分化较早,结合前人研究结果建议将狭叶牡丹作为一个独立的种。     

‘凤丹’牡丹幼胚愈伤组织诱导的优化和再生体系的建立

以‘凤丹’牡丹的幼胚为材料,从取样时期、切割接种方式、基本培养基和植物生长调节剂选择等方面进行再生体系优化。结果表明:授粉后60 d为‘凤丹’牡丹幼胚诱导愈伤的最佳取材时期;完全破碎切割成幼胚薄片比完整胚、1/2胚和1/4胚更容易获得高质量的愈伤组织,且褐化率较低;MS基本培养基添加0.162μmol·L^-1 H₂O₂可提高幼胚愈伤组织诱导率,但会增加褐化率,而在WPM基本培养基中添加不同浓度的H₂O₂,对愈伤诱导率和褐化率的影响不大;WPM基本培养基比MS更适于‘凤丹’牡丹幼胚再生;WPM+2.5 mg·L^-1 2,4-D+0.1 mg·L^-1 6-BA是诱导愈伤的最佳植物生长调节剂组合,诱导率可达93.33%;不定芽和不定根诱导的最佳组合分别为WPM+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝胶+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1     

朱顶红实时荧光定量PCR中不同组织器官内参基因的筛选

以朱顶红（Hippeastrum vittatum）不同组织器官为试验材料,通过实时荧光定量PCR技术检测肌动蛋白基因（ACT）、亲环蛋白基因（CYP）、转录延伸因子基因（EF-1α）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因（GAPDH、GAPDH2）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）这7个常用的看家基因的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1α和GAPDH2的表达水平较高,而且相对稳定;其次为TUB、TUA和GAPDH。geNorm和NormFinder软件分析结果显示,在不同组织器官中CYP和GAPDH2的表达稳定性最高,其次是EF-1α;进一步分析表明,CYP的表达稳定性虽然较高,但是其表达丰度较低,故不适合作为内参基因。BestKeeper分析表明,EF-1α和GAPDH2在不同组织器官中的表达稳定性较好。综合分析表明,EF-1α和GAPDH2在所有样品中表达量较高,稳定性较好。以筛选出来的EF-1α、GAPDH2以及EF-1α + GAPDH2作为内参基因检测朱顶红花器官调控基因PI的表达水平,结果表明,以上述两个基因及其组合为内参基因得到的PI表达模式相同,而且在花器官中的表达高于茎盘和根,基本符合PI调控花模型的机理。因此,EF-1α、GAPDH2或EF-1α + GAPDH2可作为朱顶红的内参基因进行相关基因的表达调控研究。     

牡丹泛素延伸蛋白基因ubiquitin克隆及其作为内参基因的研究

以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）为试验材料,采用RT-PCR方法获得一个牡丹泛素延伸蛋白基因Psubiquitin（PsUBI）,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为447 bp,编码148个氨基酸,GenBank登录号为KP742952。序列比对发现,该基因与其他23种植物泛素延伸蛋白核苷酸序列的相似性均在81%以上,氨基酸序列的相似性达96%。进化分析表明,牡丹泛素延伸蛋白与棉花泛素延伸蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,在牡丹不同组织器官中,相对于其他5个常用看家基因（GAPDH、GAPDH1、tubulin、tubulin2、18S rRNA）,ubiquitin的PCR扩增曲线的CT值最为恒定,尤其是在不同花器官中的CT值完全一致。进一步分析发现该基因在牡丹的根、茎、叶片、花、雄蕊和心皮组织中均恒定表达,特别是花器官中的表达量几乎完全一致。以ubiquitin作为内参基因探讨控制花器官发育的基因PsAG的表达情况,结果显示PsAG的表达模式与其作用位点相吻合,ubiquitin更适宜作为牡丹花器官研究的内参基因。     

北京地区牡丹国庆二次开花研究初探

以北京地区常见秋发牡丹品种秋发1号为试验材料,研究了在北京地区露地人工脱叶处理、人工脱叶与赤霉素(GA(3))复合处理、人工脱叶与GA(3)和乙烯利(ETH)复合处理对牡丹秋季露地二次萌芽、开花的影响.结果表明,在北京地区二次开花以8月中旬至下旬为适宜处理时间,人工脱叶与适宜浓度GA(3)的复合处理不仅能有效打破混合芽的休眠,还能促进花蕾、花枝和叶片的发育,乙烯利等化学药剂处理可使秋发1号二次开花时间推迟,并明显促进其二次叶片的发育.在完善的花芽分化基础上,综合掌握上述人工措施,可使秋发1号于国庆节前后开放,且具有较高的观赏价值.     

几种生长延缓剂对微型盆栽牡丹促成栽培的影响

以牡丹品种‘冠群芳’为试材,分别在促成栽培的萌动期、小风铃期、撒飘期采用多效唑（PP333）、丁酰肼（B9）、正丁醇和TIBA等4种植物生长延缓剂进行处理,研究其对牡丹生长及开花的影响。结果表明：3个时期比较,小风铃期施用生长延缓剂矮化效果优于混合芽萌动期,而撒飘期施用则易发生药害。4种延缓剂相比,正丁醇效果比PP333和B9好,尤其是25mg/kg正丁醇处理,花期提前2d,成花率高达100%,成花质量最好,花径达17.2cm,新枝、叶、叶柄的生长也受到明显抑制;施用TIBA对植株影响显著,但易发生药害。     

牡丹花粉活力测定方法的研究

根据不同牡丹种与品种的生物学特性,选择适宜的花粉采集时期并快速准确测定花粉萌发率,筛选花粉活力的最佳测定方法,保证育种过程中提供活力旺盛的父本花粉,为牡丹育种的成功打下基础。对3个野生牡丹种和3个栽培牡丹品种花粉萌发特性进行了对比,筛选适宜浓度的硼酸蔗糖培养液,确定适宜的花粉采集时期和花粉培养时间。野生牡丹和栽培牡丹花粉培养适宜的液体培养基均为50mg/kg硼酸＋10%蔗糖;3个野生牡丹种绽口期采集的花粉萌发率最高达90%,适宜统计的培养时间为8h,3个栽培牡丹品种以花朵初开期花粉萌发率最高,达70%-75%,适宜统计的培养时间为16h。野生牡丹和栽培牡丹花粉适宜的培养液一致,但花粉适宜的采集时期、培养时间有一定差异。     

不同浓度蔗糖及甘露醇处理对芍药切花采后品质影响的研究

本研究以芍药切花“杨妃出浴”为研究对象,分别测定了不同浓度蔗糖（10 g/L、20 g/L、50 g/L）及甘露醇（100 mM、250 mM、300 mM）处理对芍药切花花朵开放进程、开花级数及花径增大率的影响。结果表明,3个蔗糖浓度梯度对花朵开放均有一定促进作用,其中20 g/L的浓度效果最好,可作为今后配置芍药切花保鲜液的优选浓度。不同浓度的甘露醇处理均对芍药切花瓶插品质有负面影响,其中100 mM的处理浓度影响相对较小,但花朵在盛开之前也已经衰老,其余两个处理浓度直接导致了花朵无法开放。本研究结果可为今后进一步提出改善芍药切花的保鲜措施提供一定帮助。     

牡丹花粉活力测定方法的研究

根据不同牡丹种与品种的生物学特性,选择适宜的花粉采集时期并快速准确测定花粉萌发率,筛选花粉活力的最佳测定方法,保证育种过程中提供活力旺盛的父本花粉,为牡丹育种的成功打下基础。对3个野生牡丹种和3个栽培牡丹品种花粉萌发特性进行了对比,筛选适宜浓度的硼酸蔗糖培养液,确定适宜的花粉采集时期和花粉培养时间。野生牡丹和栽培牡丹花粉培养适宜的液体培养基均为50mg/kg硼酸＋10%蔗糖;3个野生牡丹种绽口期采集的花粉萌发率最高达90%,适宜统计的培养时间为8h,3个栽培牡丹品种以花朵初开期花粉萌发率最高,达70%-75%,适宜统计的培养时间为16h。野生牡丹和栽培牡丹花粉适宜的培养液一致,但花粉适宜的采集时期、培养时间有一定差异。     

脱叶处理对牡丹秋季露地二次开花的影响

该文以4个重要的秋发牡丹品种为试材,研究了脱叶处理对牡丹秋季露地二次萌芽、开花的影响.结果表明:全株脱叶是实现牡丹二次开花的关键措施,在山东菏泽地区以8月下旬至9月上旬为适宜的脱叶时间,脱落酸（ABA）、乙烯利等化学脱叶药剂处理使秋发1、2、3号品种的二次开花时间提前2～6 d,显著提高了植株二次开花质量,尤其是明显促进了二次叶片的发育.试验证明,在完善的花芽分化基础上,综合掌握植株脱叶关键措施,可使秋发牡丹于秋季特别是在国庆节前后开放,并且达到花叶并茂的效果.