猪瘟病毒E2基因自杀性DNA疫苗的构建及动物免疫试验

从含有猪瘟病毒(CSFV)Shimen株E2全长基因的重组质粒pMD18-T-E2上扩增得到带有BamHⅠ酶切位点的E2基因片段,构建重组克隆质粒pMD19-T-E2.用BamH Ⅰ酶切pMD19-T-E2和"自杀性"DNA疫苗表达载体pSCA1,构建"自杀性"DNA疫苗重组质粒pSCA1-E2.对目的基因E2的大小、插入位置、方向和读码框经PCR、酶切和序列测定进行鉴定.用纯化的阳性质粒pSCA1-E2转染PK-15细胞,转染后48 h荧光抗体法检测E2蛋白的表达;纯化的pSCA1-E2质粒分别免疫小鼠(10 μg/只)和试验猪(600μg/头),二免后分别检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数和猪血清抗猪瘟特异性抗体水平.结果表明,构建的重组质粒中E2基因的大小、插入位置、方向和读码框均正确,获得了重组表达质粒pSCA1-E2;转染后48 h可检测到转染的PK-15细胞中E2蛋白的表达.免疫小鼠产生较高水平的淋巴细胞刺激指数,免疫猪可检测到抗CSFV特异性血清抗体;表明构建的pSCA1-E2重组质粒能激发实验动物的免疫反应.     

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。     

H1N1亚型猪流感诊断方法的研究新进展

2009年,甲型H1N1流感在全球多个地方猪和人群中暴发,给人民群众的生命健康带来了巨大威胁,给经济发展和社会稳定产生了严重影响.及时快速的诊断是有效控制疫情大规模暴发的最有效途径之一.近几年随着现代分子生物学技术发展,猪流感诊断方法在快速、准确性方面有了很大提高.对H1N1猪流感概况及猪流感的诊断方法进行了综述.     

马鼻肺炎双重荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用

【目的】建立快速、准确检测马疱疹病毒 1 型（EHV1）和 4 型（EHV4）的双重荧光定量 PCR 检 测方法。【方法】以 EHV1、EHV4 的全基因组序列为基础,针对糖蛋白 B（gB）基因的保守序列,分别设计 EHV1 与 EHV4 特异性引物和探针,筛选引物,优化反应条件,分型检测马疱疹病毒（EHV1、EHV4）。【结果】 检测到 EHV1、EHV4、EIV、EAV、EVJ 和 EIAV 标准毒株,EHV1、EHV4 为阳性结果,其余病毒为阴性结果; EHV1、EHV4 DNA 模板的最低检出限为 1.47×102 copies/μL;检测 64 份临床样本,阳性检出率为 14.06%,病 毒分离证实 100% 符合。【结论】双重荧光定量 PCR 检测方法可直接应用于检测并区分 EHV1、EHV4, 并可在 短时间内获得对 EHV1/EHV4 特异性及敏感性的检测结果。     

非洲猪瘟的研究进展

非洲猪瘟是猪的一种急性、高度接触性传染性疾病,其特征是发病过程短,死亡率高达100%,临床表现为发热,皮肤发绀,淋巴结、肾及胃肠黏膜明显出血。科学有效的检测诊断方法是阻止非洲猪瘟大范围暴发流行的有效手段。为了进一步了解该病,对非洲猪瘟的流行病学、病原学、临床症状以及诊断检测技术进行了综述,从而为我国诊断、预防和控制非洲猪瘟提供理论依据。     

H9N2禽流感病毒陕西分离株HA基因的遗传变异分析

【目的】对H9N2禽流感病毒HA基因全序列进行分析,了解H9N2禽流感分离毒株HA基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank已发表的H9N2毒株的基因序列,设计了2对H9N2禽流感病毒HA基因特异性引物,运用RT-PCR方法对XL、LF和WN分离株进行了扩增,然后将PCR产物送出进行测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行了分析。【结果】XL、LF和WN 3株H9N2分离株间HA基因的核苷酸同源性为99.7%~99.9%,推导氨基酸的同源性为99.1%~99.6%;分离株与参考毒株HA基因核苷酸的同源性为96.2%~99.0%,推导氨基酸的同源性为96.2%~98.6%。通过对3个H9N2分离株间HA基因核苷酸序列的比较,发现共有5个位点的核苷酸发生突变,其中4个位点核苷酸的改变导致相应的氨基酸发生突变。HA蛋白的7个受体结合位点比较保守,但是其在551~553位缺失了潜在的糖基化位点。【结论】3株H9N2分离株裂解位点氨基酸序列完全符合低致病性禽流感的特征RSSR↓G,但是LF裂解位点附近333位脯氨酸(Pro)突变为组氨酸(His),即非极性氨基酸向极性带正电氨基酸(碱性氨基酸)转变,裂解位点的变化可能是H9N2禽流感病毒生物学特性改变的分子基础。     

非洲猪瘟病毒抗体化学发光检测方法的建立与应用

【目的】建立一种特异性强、敏感度高、操作简捷、高通量的非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)抗体化学发光检测方法,用于早期监测ASFV的流行情况。【方法】本研究以羧基磁珠作为固相载体偶联ASFV重组p72蛋白,用适量的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭,加入检测样品进行反应,以兔抗猪IgG-AP抗体作为酶标抗体,加入相应底物进行显色,优化各项反应条件,建立ASFV抗体化学发光检测方法,并对该方法的特异性、敏感度、重复性和检出率进行验证。【结果】建立的ASFV抗体化学发光检测方法蛋白与羧基磁珠偶联最适pH为7.0,最佳蛋白偶联浓度为5μg/mL,使用10%BSA溶液封闭效果最佳,反应磁珠终浓度为1.00 mg/mL,酶标二抗最佳工作稀释度为1∶40 000。同时该方法反应时间为30 min,血清稀释度为1∶512,敏感度高于商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒,与猪瘟病毒、A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒gE、猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性标准血清均无交叉反应。重复性试验中,批内变异系数为4.41%～8.70%,...     

一例贵宾犬两前肢桡尺骨双骨折病例治疗与分析

犬桡尺骨干双骨折,又称前臂双骨折,是常见的犬前臂损伤病例,多见于体型较小的犬种。报道了一只8月龄贵宾犬两前肢桡尺骨双骨折病例的诊断,采用钢板内固定术治疗,预后良好。临床上犬前臂骨折大都是桡骨、尺骨同时骨折,根据患病动物的情况采用内固定或外固定术是可行的治疗方法。     

串珠镰刀菌素对仔猪血清中猪瘟抗体水平的影响

以三元杂仔猪为材料,研究了串珠镰刀菌素对仔猪猪瘟抗体水平的影响。结果表明,试验组在免疫后的第3、4、5、6周猪瘟抗体水平较对照显著降低(P0.01)。说明串珠镰刀菌素可降低猪体内血清中猪瘟抗体水平,抑制机体体液免疫的功能。     

酶联免疫吸附试验在几种犬源人兽共患病检测中的应用

随着宠物养殖量的增加,宠物疫病也越来越受到人们的关注。宠物源性人兽共患病不仅危害宠物养殖业的健康发展,而且严重危害了人类健康甚至于生命安全。早期诊断对有效预防和控制宠物源性人畜共患病有重要意义。酶联免疫吸附试验具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强等优点,在宠物疫病检测中发挥的作用越来越大。本文对酶联免疫吸附试验在犬源性人兽共患病中的狂犬病、弓形虫病、布鲁氏茵病和钩端螺旋体病检测上的应用与研究进展进行综述,旨在促进该技术在宠物疾病检测方面的应用与推广。