猪瘟病毒E2基因自杀性DNA疫苗的构建及动物免疫试验

从含有猪瘟病毒(CSFV)Shimen株E2全长基因的重组质粒pMD18-T-E2上扩增得到带有BamHⅠ酶切位点的E2基因片段,构建重组克隆质粒pMD19-T-E2.用BamH Ⅰ酶切pMD19-T-E2和"自杀性"DNA疫苗表达载体pSCA1,构建"自杀性"DNA疫苗重组质粒pSCA1-E2.对目的基因E2的大小、插入位置、方向和读码框经PCR、酶切和序列测定进行鉴定.用纯化的阳性质粒pSCA1-E2转染PK-15细胞,转染后48 h荧光抗体法检测E2蛋白的表达;纯化的pSCA1-E2质粒分别免疫小鼠(10 μg/只)和试验猪(600μg/头),二免后分别检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数和猪血清抗猪瘟特异性抗体水平.结果表明,构建的重组质粒中E2基因的大小、插入位置、方向和读码框均正确,获得了重组表达质粒pSCA1-E2;转染后48 h可检测到转染的PK-15细胞中E2蛋白的表达.免疫小鼠产生较高水平的淋巴细胞刺激指数,免疫猪可检测到抗CSFV特异性血清抗体;表明构建的pSCA1-E2重组质粒能激发实验动物的免疫反应.     

伊维菌素脂质体的制备及其质量评价

【目的】制备伊维菌素脂质体(IVML),并对其进行质量评价。【方法】采用改良薄膜分散法制备IVML,选取卵磷脂与胆固醇质量比、伊维菌素(IVM)与卵磷脂质量比、缓冲液PBS的pH为配方影响因子,超声裂解时间、蒸发温度、冻融次数为制备工艺的影响因子,通过设计L9(34)正交试验对以上影响因子进行筛选。以筛选的最佳配方和工艺条件制备IVML,利用高速冷冻离心法测定其包封率,并对其理化性质和稳定性进行评价。【结果】IVML的制备最佳配方和工艺为:卵磷脂与胆固醇质量比为9∶1,IVM与卵磷脂质量比为1∶10,缓冲液PBS的pH为7.0;超声裂解5 min,蒸发温度40℃,冻融3次。所制备的IVML粒径为86~115 nm,平均粒径为(91.8±1.5)nm,包封率为(90.71±0.8)%(n=3),对热稳定,但对光不稳定。【结论】得到了制备IVML的最佳配方和工艺,且制备工艺简单可行;IVML外观和质量浓度未发生明显变化,性质稳定。     

猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒相关microRNA的初步筛选

本试验旨在筛选猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)内作用于猪瘟病毒(CSFV)的microRNA。通过构建CSFV3′和5′非翻译区(Untranslated region,UTR)的双荧光素酶报告基因载体,经生物信息学预测可能与CSFV相互作用的microRNA,然后瞬时共转染重组载体与microRNA的抑制物,最后通过发光检测仪测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了CSFV5′非翻译区(373 bp)和3′非翻译区(252 bp)的报告基因载体,并合成了4条预测出的microRNA(ssc-mi R-let7c、ssc-mi R-106a、ssc-mi R-18、ssc-mi R-139)的抑制物,共转染后发光检测仪检测到荧光素酶的活性被不同程度抑制。本研究发现microRNA作用位点主要在CSFV的3′-UTR,而且以上4种microRNA都对CSFV3′-UTR有不同程度的抑制作用,其中ssc-mi R-18的抑制作用比较明显。