非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。     

Rapidly quantitative detection of Nosema ceranae in honeybees using ultra-rapid real-time quantitative PCR

BackgroundThe microsporidian parasite Nosema ceranae is a global problem in honeybee populations and is known to cause winter mortality. A sensitive and rapid tool for stable quantitative detection is necessary to establish further research related to the diagnosis, prevention, and treatment of this pathogen.ObjectivesThe present study aimed to develop a quantitative method that incorporates ultra-rapid real-time quantitative polymerase chain reaction (UR-qPCR) for the rapid enumeration of N. ceranae in infected bees.MethodsA procedure for UR-qPCR detection of N. ceranae was developed, and the advantages of molecular detection were evaluated in comparison with microscopic enumeration.ResultsUR-qPCR was more sensitive than microscopic enumeration for detecting two copies of N. ceranae DNA and 24 spores per bee. Meanwhile, the limit of detection by microscopy was 2.40 × 10⁴ spores/bee, and the stable detection level was ≥ 2.40 × 10⁵ spores/bee. The results of N. ceranae calculations from the infected honeybees and purified spores by UR-qPCR showed that the DNA copy number was approximately 8-fold higher than the spore count. Additionally, honeybees infected with N. ceranae with 2.74 × 10⁴ copies of N. ceranae DNA were incapable of detection by microscopy. The results of quantitative analysis using UR-qPCR were accomplished within 20 min.ConclusionsUR-qPCR is expected to be the most rapid molecular method for Nosema detection and has been developed for diagnosing nosemosis at low levels of infection.     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜enJSRV及IFN-τ基因表达水平的分析

本研究旨在检测内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与干扰素-τ(IFN-τ)在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织的表达以及enJSRV的表达与外周血孕酮水平变化的关系。运用TaqMan实时荧光定量PCR技术和电化学发光法对enJSRV和IFN-τ在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织相对表达及孕酮水平进行了测定。实时荧光定量PCR结果显示,enJSRV和IFN-τmRNA在妊娠早期绵羊子宫内膜组织有不同程度的表达。SAS统计学软件分析得出,子宫内膜组织中enJSRV mRNA在妊娠12～14d(交配日为0d)表达较高,2～10、16～30d的表达均低于前者。IFN-τmRNA仅在妊娠12～25d表达,14d达其峰值,30d就不能检出,且差异都极显著(P<0.01)。电化学发光法结果显示,孕酮水平在妊娠2d为0.4ng·mL-1,以后升高,妊娠8～16d维持在8.3ng·mL-1左右,在妊娠19～30d孕酮水平有所下降,30d为2.5ng·mL-1。以上结果提示,子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达与外周血孕酮含量及IFN-τ的变化高度相关,且enJSRV在胎盘的形态发生及生殖生物学方面发挥重要作用。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

实时定量PCR检测逆境下盐芥ABI1基因表达水平

运用实时定量PCR的方法对盐芥ABI1基因在干旱、ABA、冷和盐胁迫下的表达情况进行了检测,并对ABI1在耐盐植物中的抗逆能力进行了分析,为粮食作物的耐逆性改良奠定基础。     

气象水文到报监测的实时性设计

到报监测是气象水文数据传输、处理等的重要环节，其实时性是关键设计目标。通过分析文件目录扫描方法和消息通知机制的应用特点，结合气象水文资料传输、处理规程及应用模式，重点阐述了结合实时性和可靠性要求的到报监测方法，并给出一种重构性强、应用灵活的到报监测模块的设计方案。     

一种油罐底板实时监漏的新方法

针对当前被广泛使用的通过罐内油位变化和感官查库对油罐底板进行实时监漏的方法存在的弊端,提出了油罐底板实时监漏的新方法,即油罐基础内钻孔油气体积分数监漏法.介绍了油罐底板实时监漏方法的探漏原理:在油罐基础上按每9m(弧长)钻取一个直达砂垫层的探漏孔,使用高灵敏度的油气含量检测仪探测到油气,可判断罐底是否发生渗漏.以实例阐述了操作步骤和现场应用情况,证明了其有效性,详述了其技术要求.基于现场实验数据,提出了汽油油罐的判漏标准,可为今后油库的扩容和改造提供借鉴.     

排种器振动种盘内种群质量实时监测方法

采用悬臂梁称重传感器测量排种器振动种盘内种群的冲击力,在分析不同参数下输出信号变化特征的基础上,设计了由加法器、精密半波整流、二阶巴特沃斯低通滤波和差动放大串联组成的信号处理电路,实现了振动状态下种群质量的实时监测。在振动种盘试验台上进行了性能试验,设定振幅为3、4、5mm,相应振动频率分别在11~13Hz、10~12Hz、9~11Hz范围,结果表明:当单位面积籽粒质量κ1.8 g/cm2时,信号处理电路输出电压Vout与κ的非线性误差小于5.5%;当κ2.0g/cm2时,由于种群振动运动的不稳定导致输出电压Vout的波动性增强,测量的非线性误差增大。信号处理电路零点输出电压随种盘振动强度的提高而增大,测量灵敏度随种盘振动频率的提高而降低,籽粒形状和力学特性差异对测量结果的影响可以被忽略,监测方法具有很好的适应性。     

农用植保旋翼无人机地面监控系统的设计与实现

植保无人机凭借其低成本、高效率、精准快速作业等优点,在农业植保领域得到快速发展,成为现代农业的一种重要装备。为了能够实时远程监控农用植保旋翼无人机的飞行状态信息,提高无人机飞行作业安全和作业质量,进行更好的飞行控制管理,设计并实现了植保旋翼无人机地面监控系统,可实现与植保无人机的远距离实时通信、监测飞行姿态、显示飞行作业轨迹和飞行控制等操作。地面监控系统采用嵌入式树莓派2作为硬件平台,2.4G无线模块实现数据收发,使用跨平台C++图形用户界面应用程序框架Qt对地面监控系统软件功能和交互界面进行开发,并制定了旋翼无人机与地面监控系统之间的数据通讯协议。该系统实际测试表明:监控系统可长时间连续稳定的工作,有效实现了对农用植保旋翼无人机实时监控与操作。