高温胁迫下条斑紫菜叶状体HSP70基因的表达谱分析

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了条斑紫菜叶状体在25℃高温胁迫下PyHSP70-1基因的相对表达量变化。定量分析显示PyHSP70-1基因表达受到高温胁迫的显著诱导。在持续高温胁迫下,PyHSP70-1表达量在8 h时达到最大,此后一直维持在较高水平,且与对照差异显著。在短暂高温胁迫结束后PyHSP70-1表达量最大,随着恢复时间的增加,其mRNA量逐渐减少,在恢复的24 h时间内,mRNA量仍然显著高于对照。结果表明PyHSP70-1是诱导型HSP,受热激诱导表达,在热激胁迫中维持细胞蛋白与膜的稳定,对细胞具有重要的保护作用。     

条斑紫菜谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是一类多功能蛋白家族,主要参与解毒和抗氧化防御过程。为了研究GST在条斑紫菜叶状体解毒过程中的作用,克隆并分析了条斑紫菜一个可溶性谷胱甘肽S转移酶基因(命名为PyGST)的基因组DNA序列和cDNA序列,采用实时荧光定量PCR研究了其在铅胁迫下的表达规律。PyGST包含一个长624 bp的完整开放阅读框,编码区内含有一个长248 bp的内含子。PyGST具有GST蛋白家族的保守碱基和保守结构域。PyGST与藻类GST的亲缘关系最近,与动物Sigma型GST的亲缘关系次之;在进化树上PyGST等大多数藻类GST与动物Sigma型GST聚为一簇,表明PyGST属类Sigma型GST。铅胁迫能显著诱导PyGST表达,说明在叶状体细胞内PyGST参与了重金属铅的解毒过程。     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.     

坛紫菜核糖体蛋白S15a基因的克隆及表达分析

坛紫菜栽培中经常遭遇高温胁迫危害而产生烂菜现象,为研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,分离并克隆高温胁迫应答的相关基因,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系Z-61叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得一条在高温胁迫条件下表达水平显著降低的基因片段,通过5'-RACE技术获得了它的全长,命名为Phrps 15a(GenBank登录号:JN991055.1).该基因序列全长676 bp,包含一个390 bp的开放阅读框编码130个氨基酸的核糖体S15a蛋白(PhRPS 15a),蛋白分子式为C664H1066N188O180S7,由3条螺旋、7个片层及8个环状连接组成,与多个物种的RPS15a蛋白具有较高的序列一致性(78％～80％).系统进化分析表明,动物、高等植物、绿藻和坛紫菜PhRPS15a蛋白均享有独立的进化分支,但坛紫菜PhRPS 15a蛋白与团藻和莱茵衣藻的亲缘关系更近.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps 15α基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫条件下,Phrps15a基因的表达水平极显著下调.     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

条斑紫菜Mu型谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

谷胱甘肽S-转移酶是动植物重要的解毒酶,分布广泛,类型众多。本研究利用生物信息学方法和RT-PCR技术获得了条斑紫菜一条新谷胱甘肽S-转移酶(PyGST2)基因的cDNA序列,该基因含有完整的开放阅读框,并且受到铅胁迫的诱导表达。PyGST2蛋白具有谷胱甘肽S-转移酶家族的保守结构域和保守氨基酸残基,与Mu型谷胱甘肽S-转移酶的序列一致性最高,与Alpha、Sigma和Pi型谷胱甘肽S-转移酶的次之,在进化树上远离高等植物的各型谷胱甘肽S-转移酶,而与动物的Mu型谷胱甘肽S-转移酶聚为一支。该Mu型谷胱甘肽S-转移酶的克隆为后续研究条斑紫菜抗逆机制奠定了基础。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹热休克蛋白HSP90a的原核表达

为证明三疣梭子蟹HSP90a蛋白与盐度胁迫的相关性,实验根据GenBank上提供的三疣梭子蟹HSP90a基因蛋白编码区序列,构建pET28-HSP90a原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3(BL21)中进行的盐度胁迫表达。结果显示,转重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌,越接近大肠杆菌盐度耐受极限值,两者差异越显著,在盐度胁迫最高值(1 050 mmol/L)下,两者差异达到10.7倍,说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹HSP90a对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。由此推测,HSP90a蛋白可能参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

KK-42对凡纳滨对虾热激蛋白基因表达的诱导作用

为探讨咪唑类物质KK-42可能的作用机制,首次克隆了热激蛋白90(HSP90)部分mRNA序列,研究了HSP90以及HSP70基因的时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。结果显示, HSP90和HSP70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSP mRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显著诱导肝胰腺HSP的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分别比相应的对照组升高了243.4%、141.3%、410.5%和121.6%、505.5%、481.7%。结果表明,KK-42处理可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺HSP90和HSP70基因的转录水平。     

草鱼HSP90基因cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼HSP90(Heat shock protein)序列(NM_131328)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼HSP90基因cDNA部分序列596 bp,获得GenBank登陆号为FJ517554.将测序结果利用DNAman软件与其他几种已知序列的鱼进行比对,结果表明,草鱼HSP90与斑马鱼、鲤、鲋的同源性依次为90%、89%、92%.同时利用半定量(Semi-quantitative,SQ)RT-PCR技术检测HSP90在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达差异.结果表明,HSP90在草鱼除了鳍外的其他11个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,但与鳃、性腺、脑、脾脏中的表达无显著差异(P>0.05),在脂肪、粘液、鳔组织中的表达显著低于其他几种组织(P<0.05),在肝脏、肌肉与肠中的表达无显著差异(P>0.05).     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

HSP90抑制剂根赤壳菌素对斑马鱼胚胎发育的影响

为研究热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育中的作用,本实验采用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的HSP90抑制剂根赤壳菌素(radicicol)对斑马鱼发育期胚胎进行处理,监测斑马鱼胚胎不同发育时期两个HSP90功能抑制标志基因BAG3(BCL2-associated athanogene3)和HSPB1(heat shock protein beta-1)的mRNA的表达水平,并观察不同发育时期的胚胎发育状况。结果如下:(1)实时荧光定量PCR结果显示,BAG3和HSPB1 mRNA水平在根赤壳菌素处理胚胎12 hpf(hours post-fertilization,hpf)或24 hpf后显著增高,Western blot检测到5μmol/L根赤壳菌素处理胚胎24 hpf后HSP70表达上调,证明该实验条件下HSP90功能受到抑制;(2)根赤壳菌素处理后斑马鱼胚胎发育变缓,胚胎成活率统计显示:2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L根赤壳菌素处理24 hpf胚胎成活率分别是95%、77%、35%,成活率随根赤壳菌素浓度的增高而降低;(3)5μmol/L根赤壳菌素处理72 hpf可见部分个体色素沉积减少、心包膜增大、肌肉萎缩等发育畸形。研究结果证明HSP90在斑马鱼胚胎发育过程中发挥重要的作用,根赤壳菌素在5μmol/L时已达到较佳抑制效果且成活率较高,而且胚胎发育出现了各种形态学变化,为后期研究HSP90调节斑马鱼胚胎发育奠定了基础。     

杂色鲍HSP90基因启动子的功能分析

为探索启动子在热休克蛋白90表达调控中的作用,本研究在课题组已有杂色鲍HSP90基因cDNA的基础上,通过Genome walking、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的5′调控区序列。在翻译起始位点(ATG)和第一外显子(长度94 bp)之间有一个809bp的内含子,第一外显子之前的5′调控区共2800 bp,从预测的转录起始位点(A)起,共2811 bp。在转录起始位点(A)上游–30 bp处存在TATA box。潜在的转录因子结合位点包括ATF、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalpha、NF-1、NF-κappa B、GATA-1、Sox-2等。CpG岛预测软件分析其含1个CpG岛,长度为131 bp。实验构建了8个启动子缺失片段的萤火虫荧光素酶表达载体,通过瞬时转染293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,确定杂色鲍HSP90基因核心启动子区位于–98~83 bp。在–624~–539 bp,Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这3个转录因子都起到一定的抑制作用。     

Differential HSP90α expression in fish hepatocytes from polluted estuary during summer

The molecular chaperone, heat shock protein 90α (HSP90α), plays an important role in protein folding, degradation of denatured proteins and steroid activation. It is essential for the maintenance of cellular integrity and survival when induced in response to environmental, physical and chemical stresses. In the present investigation the effect of environmental stress on HSP90α expression was examined in grey mullet Mugil cephalus living in either a contaminated (Ennore) or uncontaminated (Kovalam) estuary over two seasons: Hepatocytes were isolated from grey mullet of both estuaries. Oxidative stress was determined along with HSP90α in these fish. Additionally, immunohistochemical changes were studied to confirm the HSP90α expression. Comparison of the results revealed enhanced hepatocyte oxidative stress and HSP90α expressions in fish from Ennore to a significant extent than fish from Kovalam. Also, the results showed significant seasonal variations with maximum expression observed during summer compared to the monsoon season. Overexpression of HSP90α in hepatocytes exposed to chronic environmental stress by pollutants may confer differential effects on cell survival by protecting against oxidative stress induced changes. The results also indicate that seasonal variations have significant effect on the HSP90α expression.     

Molecular characterization and expression analysis of heat shock proteins 40, 70 and 90 from kuruma shrimp <Emphasis Type="Italic">Marsupenaeus japonicus</Emphasis>

Heat shock proteins (HSPs) are proteins that are expressed more strongly when the cells are exposed to physiological and stressful conditions. In this study, the full-length cDNAs of heat shock proteins 40 (MjHSP40), 70 (MjHSP70) and 90 (MjHSP90) were cloned from kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus. The open reading frames (ORFs) of the cDNA clones have lengths of 1,191, 1,959 and 2,172 bp and encode 396, 652 and 723 amino acid residues, respectively. The predicted MjHSP40 amino acid sequence contains a J domain, a glycine/phenylalanine-rich region, and a central domain containing four repeats of a CxxCxGxG motif, indicating that it is a type I HSP40 homolog. The signature sequences of the HSP70 and HSP90 gene families are conserved in the MjHSP70 and MjHSP90 amino acid sequences. The deduced amino acid sequences of MjHSP70 and MjHSP90 share high identity with previously reported shrimp HSP70s and HSP90s, respectively. The expression of MjHSP90 mRNA increased at 32°C. Additionally, the expressions of MjHSP40, MjHSP70 and MjHSP90 mRNAs increased in defense-related tissues (i.e., hemocytes and lymphoid organ) when the shrimp were challenged with white spot syndrome virus.