坛紫菜丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及表达特征

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。     

坛紫菜优质新品系（Q-1）主要经济性状的研究

对杂交选育的坛紫菜优质品系（Q-1）和人工养殖的坛紫菜（对照组）进行叶状体生长、藻体厚度、4种色素含量、粗蛋白、氨基酸含量的测定以及丝状体的生长发育等实验。结果表明，（1）（Q-1）F2、F3叶状体生长迅速，不易成熟；3～4cm的F。叶状体经过10～15d的培养，平均日增长量高达（8．33±1．01）cm，分别为父、母本的1．4和2．7倍；（2）F3叶状体在第1次剪收时藻体厚度为（21．0±1.5）μm，仅为对照组厚度的52％，第2次剪收时为（25．6±1．9）μm，为对照组的56％；F2剪收1次后藻体的长度、宽度和鲜重平均日增长量分别为对照组的2．1、2．4和2．2倍；（3）F2叶状体的总藻胆蛋白含量为（109．52±0．94）mg／g，为对照组的1．6倍；粗蛋白的含量高达（41．71±．11）g／100g，比对照组高27％；F。叶状体第1次剪收时叶绿素a的含量高达（7．66±0．19）mg／g，比对照组高13％；（4）F3叶状体第1次剪收时呈味氨基酸中鲜味氨基酸与甜味氨基酸的总量为2．49g／100g，为对照组的1．8倍；必需氨基酸含量为15．66g／100g，比对照组高13％；（5）（Q-1）和对照组的丝状体在29℃分别培养30～40d时，90％的营养藻丝发育成孢子囊枝。     

坛紫菜杂交品系优势的初步评价

通过坛紫菜诱变选育品系和野生选育品系间杂交,筛选出了4个经济性状优良的杂交品系(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ);杂交品系的子代表现出较大的杂交优势,既具有亲本优势,又具有超亲优势;品系Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的3～5cm幼苗经过10d培育,平均日增重量的超标优势分别达12.35%、139.78%、107.57%和173.52%;杂种优势指数达99.83%、213.07%、184.44%和243.05%;品系Ⅱ耐高温能力较强,在29℃水温中可正常生存10d以上;品系Ⅲ在4个杂交品系中生长最快,培育20d时藻体的平均长度是父本的1.29倍,总藻胆蛋白含量最高,达(103.83±0.49)mg/g干品;品系Ⅳ和Ⅴ藻体宽而薄,不易腐烂和老化,其中品系Ⅳ叶绿素含量高达(9.79±0.48)mg/g干品,比母本高46.21;从杂交品系的性状稳定性来看,品系Ⅱ的F2和F3叶状体长度生长相对稳定,品系Ⅲ的F3叶状体经过选育后,生长性能比F2叶状体更加突出。和F2叶状体相比,品系Ⅳ的F3各项指标表现出较大的稳定性。本研究为坛紫菜杂交育种的应用积累了有用资料。     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

低温胁迫下弓葵幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的变化

 低温胁迫下弓葵( Butia capitata Becc) 幼苗叶片的MDA 含量逐渐增加, 膜脂过氧化作用增强。- 8 ℃条件下的膜脂过氧化作用明显强于2 ℃。细胞膜透性在2 ℃条件下变化不大, - 8 ℃时则随低温胁迫时间延长而急剧上升, 细胞膜受到伤害。- 8 ℃胁迫下细胞保护酶SOD、POD 和CAT 活性短期(6 h) 内升高,然后下降, 24 h 以后3 种保护酶受到低温胁迫的严重抑制。在2 ℃胁迫下, SOD 活性在6 h 内变化不大, 随后下降; CAT活性变化趋势与- 8 ℃时相似, 但变化幅度较小; POD 虽也呈现先升后降的趋势, 但降幅明显小于升幅, 至48 h 时POD 活性仍维持较高水平。2 ℃低温胁迫不是抑制而是促进POD 活性的提高。     

坛紫菜耐低氮磷品系选育的研究

在含氮量仅为海区的1／100、含磷量仅为海区的1／15的低氮、磷环境下,对人工选育和建立纯系的坛紫菜褐绿色、红棕色品系3代叶状体（F1、F2、F3）的耐受力情况及生长情况进行研究,发现2个品系的藻体均具有极强的耐低氮、磷能力：1）褐绿色藻体在低氮、磷环境下培养21d才停止生长,叶片无成熟现象,仅轻微的腐烂和萎缩．3～4cm长的藻体培养7～9d时的长度日生长量是对照组的4．73倍,鲜重日增重率是对照组的5．29倍;培养18～21d时的长度日生长量为（0．86±0．27）cm,鲜重日增重率为（5．32±0．21）％．褐绿色品系F3代的平均长度比对照组长28．7cm．2）红棕色藻体在相同条件下培养15d后停止生长,叶片无成熟、腐烂和萎缩,3代叶状体在低氮、磷甚至无氮、磷环境下的耐受力和生长状况均比较稳定且有所提高,遗传性状比较稳定．3～4cm长的红棕色藻体在低氮、磷环境下培养7～9d时的长度日生长量是对照组的4．95倍,鲜重日增重率是对照组的3．58倍;培养13～15d时藻体的长度日生长量为（1．92±0．53）cm,鲜重日增重率为（13．61±0．46）％．F3代的平均长度比对照组长23．16cm．3）通过选育可以看出褐绿色品系比较耐低氮、磷,该品系可以较好地解决养殖过程中低氮、磷环境对于紫菜养殖所造成的危害,缓解由于养殖密度过大而造成的病害发生和减产、减收现象．     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用，对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析，结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间，可以分为ITS1区，5.8S区和ITS2区3个部分，其中5.8S区片段的长度完全一致，均为160 bp；ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近，只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异，序列同源性在95.82％~99.73％之间，而5.8S区序列则完全一致，但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异，序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

坛紫菜诱变育种的初步研究

近十几年来,坛紫菜品种退化、产量降低、质量下降,本实验通过诱变处理,筛选和培育优质高产的坛紫菜新品系.坛紫菜野生丝状体经一定剂量60Co-γ射线辐照后,子代叶状体发生了变异,经大量培养后筛选出紫色突变体(3号Ⅰ)和经济性状优良的个体(7号Ⅰ和7号Ⅱ),通过体细胞酶解和单克隆技术快速获得诱变选育纯系,并对其主要经济性状进行了研究.其主要特征:[1]7号Ⅰ:叶片宽[(2.99±0.61)cm]、生长快(30cm以上的藻体长度平均日增长量可达6.51cm,比对照组快55.3%)、耐高温(29℃正常生长,比对照组高2℃以上)、总藻胆蛋白含量高(104.86mg·g-1干品,比对照组高39.0%);[2]7号Ⅱ:藻体窄、生长快(30cm以上的藻体长度平均日增长量可达4.26cm,比对照组快58.7%)、叶片薄(藻体中部厚度仅为22.5～27.5μm,比对照组薄29.6%)、总藻胆蛋白含量高达104.24 mg·g-1干品,比对照组高39.4%);[3]3号Ⅰ:藻体紫色,叶片薄,藻体中部厚25.0～32.5μm;[4]7号Ⅰ和7号Ⅱ在生产上应用,产量分别达309.6kg·666.6m-2和291.5kg·666.6m-2,比对照组高37%和29%.     

坛紫菜品系间杂交分离色素突变体及其特性的初步研究

以野生选育的坛紫菜(Porphyra haitanensis)为母本,诱变选育全棕红的品系为父本进行杂交实验,从杂交子代大量叶片中,筛选出1株褐黄色素突变体、1株翠绿色与野生色相嵌的嵌合体和1株褐绿色与野生色相嵌的嵌合体。通过酶法分离突变体的营养细胞,单性生殖获得丝状体;分别使丝状体成熟并放散壳孢子,然后单株培养和筛选获得褐黄、翠绿和褐绿色子代叶状体。实验进行50 d。结果:(1)褐黄色突变体藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量低;孢子囊枝的细胞较小,且大量形成时间比亲本晚15 d;幼苗培养初期日平均生长量仅为(1.22±0.28)cm,当叶片长到60 cm左右时生长优势逐步凸显,日平均生长量可达(7.50±1.18)cm;(2)翠绿色丝状体容易成熟,发育方式特殊,营养藻丝不经过藻丝加粗阶段,直接由球形细胞发育成孢子囊枝和壳孢子囊;翠绿色叶状体藻红蛋白含量低,仅有(5.513 0±1.049 6)mg/g(干品);叶状体生长快速,60 cm长的藻体日平均生长量高达(11.95±2.33)cm;(3)褐绿色突变体藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白这3种色素蛋白和叶绿素的含量均较低;藻丝细胞短且细,叶状体生长速度较慢。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。