坛紫菜种质材料DNA指纹图谱的构建

采用20对简单重复序列(SSR)引物对福建省坛紫菜种质资源库中保存的44个坛紫菜种质材料进行了遗传分析,共检测到了81个多态性位点,每对引物检测到的等位基因介于2~6个之间,平均为4.05个,引物的PIC值介于0.15~0.79之间,平均为0.57。然后根据3对引物(Phes08,Phes03和PC13)扩增出的16个多态性位点构建了44个坛紫菜种质材料的指纹图谱库,使得每一种质材料均具有其特异的DNA指纹图谱。并根据指纹图谱中各扩增位点条带的有无,将指纹图谱转化成了计算机可以识别的数码指纹,开发了相应的数码指纹识别软件,为坛紫菜种质的自动化鉴定及坛紫菜种质资源库的信息化管理奠定了基础。     

珠母贝属6个种的ITS 2分子标记研究

对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、白珠母贝、黑珠母贝、长耳珠母贝、黑珠母贝和合浦珠母贝6个种的内部转录间隔区2(ITS2)序列及其两侧的5.8S和28S的部分序列进行了比较分析。其中黑珠母贝的序列来自GenBank。PCR扩增片段大小为600bp左右,测序结果表明,ITS2长211～254bp,两端的5.8S和28S分别长84bp和272bp(均含引物)。序列比对分析结果表明,5.8S和28S序列高度保守,不适合于种类鉴定,而ITS2序列高度变异,270个比对位点中有146个位点发生突变,其中72个位点发生插入/缺失突变。除白珠母贝和黑珠母贝之间的遗传距离较小外,其余种类之间的遗传距离远远大于种内遗传距离。基因型分析表明,每个种具有各自特有的基因型。基因型和序列变异分析表明ITS2序列可作为珍珠贝种类鉴定的分子标记。可用于种间、杂交育种、幼体和珍珠贝肉等材料的种类鉴定与遗传分析。     

基因条码在条斑紫菜(Pyropia yezoensis)不同品系间种质鉴定中的适用性

为寻找适宜的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)品系间种质分子标记鉴定法,利用4种基因条码(RUBISCO Spacer、UPA、Cox2-3和ITS-5.8S)对产自中国和日本的6个条斑紫菜品系的亲缘关系进行了分析研究.结果显示,在6个条斑紫菜品系中,上述4种基因条码的序列同源性较高,同源性为97.8％-100％,其中,RUBISCO Spacer序列的同源性为100％.UPA序列的同源性分析结果显示,在中国产的LS、B4、HT和TM18品系中,该序列完全相同,但与日本产的GT和ROS-2两个品系的序列有差异,该序列的同源性为99.2％.在6个品系中,Cox2-3和ITS-5.8S序列的同源性相对较低,分别为97.8％-99.2％和98.4％-99.8％.根据UPA、Cox2-3和ITS-5.8S基因条码通过邻接法构建的系统进化树显示,依据ITS-5.8S和UPA序列均能分别区分中国产的4个品系(LS、B4、HT和TM18)与日本产的两个品系(GT和ROS-2),分别形成两个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系一致.但利用ITS-5.8S序列均能对中国产的4个品系和日本产的两个品系进行再区分,而利用UPA序列却无法对中国产的4个品系进行再区分,只能区分日本产的两个品系.使用Cox2-3序列则将GT、ROS-2、LS和TM18这4个品系聚成一个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系不一致.上述结果说明,利用ITS-5.8S序列对本研究的6个条斑紫菜品系进行种质鉴定,效果最好.     

基于SCAR标记的坛紫菜“闽丰1号”多重PCR鉴定技术的建立

为建立坛紫菜“闽丰1号”(Z-26)品系的种质分子鉴定方法,采用300条RAPD引物对6个坛紫菜纯系进行标记扫描,从中筛选出“Z-26”品系的特异性随机扩增多态DNA(RAPD)标记9个,经克隆和测序,其中两个特异性标记成功转化为特异SCAR标记(Z26-600和Z26-360),标记片段大小分别为530 bp和242 bp.并进一步通过4个不同实验验证,确定Z26-600和Z26-360两个标记是坛紫菜“Z-26”品系的特异和稳定性标记.最后为进一步简化种质鉴定程序,建立更为便捷和准确的种质鉴定方法,经过条件优化,以此两个标记为基础建立了坛紫菜“Z-26”品系的多重PCR鉴定方法,该方法可以在一次PCR反应中同时鉴定两个特异性标记.     

4 种大型水母类ITS-5.8S rDNA 序列分析及其在钵水母类系统分析中的应用

由于钵水母类生物地理学研究的缺乏以及不同时期形态变异较大等原因,对其分类鉴定比较混乱和困难。为弥补形态学分类的缺陷,采用通用引物PCR扩增法,测定了分布于黄海北部和辽东湾海域海蜇(Rhopilema esculentum)、沙蜇(Nemopilema nomurai)、海月水母(Aurelia sp.)、白色霞水母(Cyanea nozakii)4种大型水母的ITS-5.8S rDNA序列,同时利用Gen Bank数据库中已有的钵水母纲(Scyphomedusae)ITS1(the Ribosomal First Internal Transcribed Spacer)同源序列对其进行序列分析并构建系统树,分析ITS1序列片段在大型水母种类鉴定方面的可行性及其在钵水母类系统及演化中的应用。结果显示,4种水母的ITS-5.8S rDNA序列变异较大且具有明显的序列长度多态性,序列长度范围675~833 bp。钵水母纲很多种类的ITS1序列具有种内长度多态性现象,这种长度多态性主要是由于微卫星重复次数不同所造成的。钵水母纲科间遗传距离为0.295~0.491,种间遗传距离为0.024~0.812;除白色霞水母和海蜇外,种内个体间遗传距离为0.000~0.099。采用ML法(maximum likelihood)和贝叶斯法(Bayesian)构建的分子系统树拓扑结构不完全相同且与形态分类学的观点不太一致。研究表明,ITS基因序列在钵水母纲不同阶元间变异较大,适合于钵水母纲种类鉴定和属内种间水平的系统进化研究。     

基因条码在条斑紫菜(Pyropia yezoensis)不同品系间种质鉴定中的适用性

为寻找适宜的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)品系间种质分子标记鉴定法,利用4种基因条码(RUBISCO Spacer、UPA、Cox2-3和ITS-5.8S)对产自中国和日本的6个条斑紫菜品系的亲缘关系进行了分析研究。结果显示,在6个条斑紫菜品系中,上述4种基因条码的序列同源性较高,同源性为97.8%–100%,其中,RUBISCO Spacer序列的同源性为100%。UPA序列的同源性分析结果显示,在中国产的LS、B4、HT和TM18品系中,该序列完全相同,但与日本产的GT和ROS-2两个品系的序列有差异,该序列的同源性为99.2%。在6个品系中,Cox2-3和ITS-5.8S序列的同源性相对较低,分别为97.8%–99.2%和98.4%–99.8%。根据UPA、Cox2-3和ITS-5.8S基因条码通过邻接法构建的系统进化树显示,依据ITS-5.8S和UPA序列均能分别区分中国产的4个品系(LS、B4、HT和TM18)与日本产的两个品系(GT和ROS-2),分别形成两个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系一致。但利用ITS-5.8S序列均能对中国产的4个品系和日本产的两个品系进行再区分,而利用UPA序列却无法对中国产的4个品系进行再区分,只能区分日本产的两个品系。使用Cox2-3序列则将GT、ROS-2、LS和TM18这4个品系聚成一个大分支,其聚类结果与实际亲缘关系不一致。上述结果说明,利用ITS-5.8S序列对本研究的6个条斑紫菜品系进行种质鉴定,效果最好。     

坛紫菜叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据日本kazusaDNA研究所收录的坛紫菜EST序列AV434021和AV433683设计引物,对坛紫菜配子体的RNA进行RT-PCR扩增,得到产物长度为480 bp。利用DNAstar、Clastal1.81等专业软件进行分析,结果表明,所得产物为紫菜叶绿体的psaA基因片段,其G C含量为55.9%。G C含量明显高于A T的含量;对按核酸序列推导的蛋白序列进行二级结构和三级结构预测,该蛋白存在3个α螺旋和2个β折叠。     

中国、日本和澳大利亚珍珠贝的ITS 2序列特征分析

对中国、日本和澳大利亚的珍珠贝核糖体DNA第二内部转录间隔子(ITS2)的序列特征进行了分析。PCR扩增产物包括5.8S基因部分序列、ITS2基因和28S基因部分序列。去除引物序列后5.8S基因片段长64bp,ITS2长230～237bp,28S基因片段长249bp。共分析了16个基因型的序列特征,结果表明,5.8S和28S基因片段高度保守,仅28S有1个碱基位点突变;而ITS2变异大,237个比对位点中有20个位点发生突变,其中12个位点为缺失/插入突变,4个简约信息位点。在碱基组成中,5.8S和28S的GC含量(58.1%～59.4%)高于AT含量,也高于ITS2的GC含量(51.3%～52.0%),ITS2的GC含量与AT含量相差不大。碱基组成中5.8S的A碱基含量较低,28S的T碱基含量较低,存在较大的碱基偏倚性。3个地理群体内和群体间的遗传距离都很小(0.010～0.013),且相互重叠。从基因型数据看,3个群体既有各自独立的基因型,也有共享基因型。但从序列的碱基变异数据看,3个群体没有各自独有的突变位点。上述结果表明,3个地理群体既具有丰富的遗传多样性,又具有高度的遗传一致性,即亲缘关系近,可能存在基因交流,或者分化时间不长。丰富的遗传多样性有利于合浦珠母贝的遗传选育。     

中华绒螯蟹核糖体DNA全序列分析

核糖体DNA通常被选作系统发育研究的分子标记,核糖体DNA中IGS部分序列的变异在一定程度上影响着生物的生长。报道了中华绒螯蟹核糖体DNA全序列的分离和序列特征。中华绒螯蟹核糖体DNA全长11660bp,包括18S(1873bp),ITS1(317bp),5.8S(163bp),ITS2(614bp),28S(4461bp)和IGS(4240bp);不同部分AT含量在40.1%～48.6%之间,低于果蝇(55.8%～80.0%),高于鲤(22.0%～43.7%)。平均100个核苷酸含简单重复序列(SSR)数由高到低依次为ITS2(0.98%),IGS(0.49%),28S(0.38%),ITS1(0.32%),18S(0.21%),5.8S(0%)。个体内差异分析结果表明,中华绒螯蟹个体内存在两类ITS2序列,其中一类在405nt处有一12bp(CGCAGGACCACC)插入序列。中华绒螯蟹rDNA的IGS部分长4240bp,AT含量为42.6%。IGS部分包含一个有约7个连续136～139bp单元组成的重复序列区,重复序列单元中存在XhoⅠ内切酶位点,为河蟹特有的重复序列;重复序列区后有一个由182个碱基对...     

坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。     

Molecular divergence and application of the ITS-5.8S rDNA and RUBISCO spacer in <Emphasis Type="Italic">Porphyra haitanensis</Emphasis> Chang et Zheng (Bangiales,Rhodophyta)

To select a reliable and sensitive method for discriminating strains of Porphyra haitanensis, the nucleotide sequence of the internal transcribed spacer 1 to internal transcribed spacer 2 regions (ITS-5.8S) of nuclear ribosomal DNA and the intergenic spacer region of RUBISCO were compared in five wild and five cultivated Porphyra haitanensis strains. Based on molecular analyses, sequences of ITS-5.8S (about 1,210 bp) could be divided into three regions: ITS1, 5.8S, and ITS2. The ITS1 and ITS2 sequences of each strain differed, even between individuals collected from the same site. In contrast, 5.8S rDNA and RUBISCO spacer sequences were identical among the ten P. haitanensis strains, although differences were found among different Porphyra species. Phylogenetic analysis also supported these conclusions. These sequence features of highly conserved regions and diversified regions that occurred repeatedly in ITS-5.8S could be useful in discriminating germplasm of P. haitanensis strains or Porphyra species. In contrast, the RUBISCO spacer is only suitable for identifying Porphyra species. New coupled primers were designed to amplify only the 5.8S rDNA and ITS2 region of Porphyra. The sequences of these amplified fragments can be readily used to identify germplasm or to perform phylogenetic analysis of Porphyra spp.     

Phylogenetic analysis of noxious red tide flagellates Chattonella antiqua, C. marina, C. ovata, and C. verruculosa (Raphidophyceae) based on the rRNA gene family

ABSTRACT:   Four species of Chattonella , which are well known to form red tides that are lethal to fish, were subjected to phylogenetic analysis on the basis of the ribosomal RNA genes (rDNA), 5.8S rDNA, 18S rDNA, 28S rDNA, and the flanking internal transcribed spacers 1 and 2 (ITS1 and ITS2). The 18S rDNA sequences of C. antiqua , C. marina , and C. ovata isolated from different regions in Japan were compared. They were found to be identical with each other in a sequence 1818 bp long. The sequences of the D1/D2 region in the 28S rDNA, 5.8S rDNA, and ITS region that are known to be more variable regions were also found to be identical. These homogeneities of the rRNA gene family revealed the extremely close relatedness of C. antiqua , C. marina , and C. ovata . The sequences of C. verruculosa were different from those of these three species , resulting in an 89.2% homology in the 18S rDNA sequences, 70.4% homology in the D1/D2 region in the 28S rDNA sequences, and an 81.5% homology in 5.8S rDNA sequences and the ITS regions. Chattonella verruculosa was grouped within a single cluster composed of Dictyochophyceae rather than the other species of Raphidophyceae.     

太平洋牡蛎核糖体DNA转录间隔子和线粒体基因片段序列测定

以相应引物经PCR扩增了太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)的核糖体转录间区域 (ITS 1和ITS 2 )及线粒体 16SrDNA和COI基因片段。PCR产物经T 载体连接后进行克隆和测序 ,分别得到长度为 5 4 3、791、5 30和 70 0bp的核苷酸序列。 4个DNA片段的A、T、G和C碱基含量分别为 2 3.5 7%、2 0 .0 7%、2 9.4 7%和 2 6 .89% (ITS 1) ,2 7.4 3%、19.2 2 %、2 7.0 5 %和2 6 .30 % (ITS 2 ) ,2 9.2 5 %、2 9.2 5 %、2 3.0 2 %和 18.4 9% (16SrDNA) ,2 2 .71%、39.4 3%、2 0 .4 3%和 17.4 3% (COI)。实验证明ITS 1和ITS 2引物在贝类中通用性良好。文中同时讨论了 4个序列在我国几种牡蛎的种类鉴别及相关研究的应用潜力     

Natural hybridization between <Emphasis Type="Italic">Pinctada fucata</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Pinctada maculata</Emphasis> inferred from internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal RNA genes

ABSTRACT:   Genetic evidence of the occurrence of natural hybridization between female Pinctada fucata and male Pinctada maculata among wild pearl oysters ( n  = 20) collected for use as the mother shell for private pearl farming in the Oshima Strait at Amami-o-shima, Kagoshima Prefecture, Japan, were obtained. A polymerase chain reaction-based species identification method for Pinctada was developed using polymorphisms in the internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA (rRNA) gene. This method enabled the amplification of the ITS regions using a primer set specific for P. maculata and P. fucata . However, 10 of 20 individuals morphologically identified as P. fucata had sequences specific to both P. maculata and P. fucata in the ITS region. These putative hybrids showed sequences of a maternally inherited mitochondrial 16S rRNA gene, identical to that of P. fucata . Shells of the putative hybrids were difficult to discriminate from those of P. fucata exhibiting similar taxonomic traits. Moreover, the hybrids exhibited slower growth than P. fucata but faster growth than P. maculata .     

Complete nuclear ribosomal DNA sequence analysis of Pacific abalone <Emphasis Type="Italic">Haliotis discus hannai</Emphasis>

Pacific abalone Haliotis discus hannai (Haliotidae, Gastropoda) is an economically important shellfish species in northern China. The complete nuclear ribosomal DNA (nrDNA) of Pacific abalone was amplified, sequenced, and analyzed. The length of the nrDNA was determined to be around 10.7 kb, and to contain, in order, small subunit ribosomal RNA (nrSSU) genes (1871 bp), internal transcribed spacer (ITS, 759–762 bp), large subunit ribosomal RNA (nrLSU) gene (3411 bp), and an intergenic spacer (IGS, 4624–4654 bp). The SSU and LSU regions were almost identical in different individuals, and show little variation from those of other abalone species. The two different variations of the ITS2 region were presented, and this phenomenon also existed in other species. A phylogeny tree was constructed, based on ITS region sequence datasets, to determine the evolutionary relationships of abalones. Abalones have two major subclades, mainly distributed in the North Pacific, Europe and Australia. The IGS region of the nrDNA was sequenced and analyzed for the first time. Several repeat fragments were present upstream of the sequence, and were significantly different between individuals (93.86% sequence identity). The complete nrDNA sequence will be useful for the classification, identification, phylogeny, germplasm management, and breeding of this shellfish.     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间，尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间，很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析，以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp，测序结果表明，（去除引物后）18S长146bp，5．8S长66bp，不同种类之间无差异；ITS1长383-483bp，因种类不同而异，其GC含量大于AT含量，达到67．1％。序列比对分析结果表明，18S和5．8s片段高度保守，但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开；18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点，可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大，系统发育分析表明，所研究的5个种聚成2个类群，尼罗与尼奥罗非鱼为一组，莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小，尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006；莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间；两组罗非鱼之间的遗传距离较大，在0．030-0．035之间，表明罗非鱼ITS1序列多态性较高，适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列，细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

牙鲆和半滑舌鳎5S rDNA基因的染色体定位及鲽形目5种鱼类的分子系统学分析

利用荧光原位杂交(FISH)技术将5S rDNA基因定位在牙鲆和半滑舌鳎染色体上,结果表明,5S rDNA基因在雌、雄性半滑舌鳎的一对同源染色体上分别存在2个杂交信号位点;在二、三倍体牙鲆的同源染色体上分别存在2个和3个杂交信号位点,杂交信号明显且特异。本研究首次将5S rDNA基因定位在半滑舌鳎和三倍体牙鲆的染色体上,为牙鲆及半滑舌鳎倍性鉴定、染色体鉴别提供了有效方法。此外,根据牙鲆5S rDNA基因编码区序列设计引物,扩增出大菱鲆和半滑舌鳎5S rDNA基因编码区序列,与鲽、塞内加尔鳎、大口黑鲈、七鳃鳗的5SrDNA基因序列进行同源性比较后发现,5种鲽形目鱼类5S rDNA基因序列同源性高达98.3%,系统发生分析结果显示5种鲽形目鱼类聚为一支;各序列中GC含量均显著高于AT含量。