ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用=Application of ISSR markers in germplasm identification of different color’s Porphyra haitanensis filament strains［刊，中］/谢潮添（集美大学水产学院，厦门361021）,纪德华,陈昌生,徐燕,张元//水产学报，—2007，31(1).-105～111 用ISSR分子标记技术对4个不同色泽坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状体品系（分别为桔黄色，褐绿色，棕红色和紫色）及1个野生型对照丝状体品系（褐红色）进行了遗传分析，共筛选出11条引物，PCR反应得到了129个扩增位点，多态位点比率达88.4％，有效等位基因数为1.6369，期望杂合度为0.3609，Shannon多样性指数为0.5265；根据Nei方法计算了这5个坛紫菜丝状体品系间的遗传相似性系数和遗传距离，结果发现4个不同色泽丝状体间的平均遗传距离为0.5727，它们同野生型对照的平均遗传距离为0.6564，同时应用UPMGA法对它们进行了聚类分析。最后应用引物812扩增的4个多态性位点构建了这5个不同坛紫菜丝状体的DNA指纹图谱，使每一品系都具有独特的DNA指纹，并将其转化成了计算机可以识别的数码指纹，可以方便地应用于坛紫菜丝状体的种质鉴定中。结果表明ISSR分子标记技术可以作为坛紫菜丝状体种质鉴定的有效技术手段，提供快捷、准确的鉴定结果。图3表5参24 关键词：坛紫菜; ISSR标记; 遗传分析; 种质鉴定 E-mail: cschen@jmu.edu.cn     

条斑紫菜6个品系的SRAP分析

为鉴别条斑紫菜不同品系的种质,使用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记对条斑紫菜的5个选育品系和1个野生品系进行遗传分析,结果从35对引物组合中筛选出可扩增出稳定清晰条带的组合11对,共获得131个扩增位点,其中多态性位点125个,多态性比例高达95.42%。6个品系 间的遗传距离为0.364 3～0.867 9,平均为0.593 0。用UPGMA法进行聚类分析,结果将6个品系分为2个群,所反映的亲缘关系与各品系的来源基本一致,说明SRAP 标记技术可以成为条斑紫菜品系间遗传分析的有效工具。在131个多态性位点中,选择扩增出的4个位点构建了6个品系的指纹图谱。另外,通过ME1/EM6引物组合 扩增得到耐高温品系TM-18的特异性条带,经回收测序和重新设计引物,该条带在其丝状体和叶状体DNA中均能稳定地被扩增出来,可用于该品系的种质鉴别 。     

5个紫菜属物种丝状体的微卫星初步遗传分析

文章利用68对微卫星引物对坛紫菜（Porphyra haitanensis）、半叶紫菜（P.katadai）、条斑紫菜（P.yezoensis）、少精紫菜（P.oligospermatangia）和皱紫菜（P.crispata）5个紫菜属物种的丝状体进行初步的遗传分析,共筛选出20对高多态性适用引物,在10份紫菜丝状体样品扩增位点的多态性比例为95.24%,每对引物可扩增的等位基因位点数为1.22～4.05,平均为2.37;各样品之间的遗传多样性指数为0.254 6～0.899 4;不同物种的遗传距离为0.106 0～1.406 6,同一物种的丝状体材料优先聚类为一支,表明筛选出的微卫星引物具有良好的遗传分辨能力。     

微卫星标记在坛紫菜丝状体品系DNA指纹构建中的应用

用从条斑紫菜EST数据库中筛选合成的微卫星引物对8个坛紫菜丝状体品系进行微卫星DNA指纹扩增。5个微卫星引物共扩增出32条带，其中3对引物所扩增出的5个条带(AU192094—127、AU187410—335、AU187410—190、AU194267—203和AU194267—328)被用来构建8个坛紫菜丝状体品系的DNA指纹。在这个图谱中，每个丝状体品系都有独一的指纹模式，彼此很容易被区分开。所获得的DNA指纹图谱，可用来进行孟德尔分离研究，及为坛紫菜纯系鉴定提供分子基础。     

野生坛紫菜种群遗传多样性的ISSR分析

采用简单序列重复区间(ISSR)分子标记技术对福建省的3个野生坛紫菜(Porphyrahaitanensis)种群共60个个体进行了遗传多样性分析.15条引物共扩增出222个位点,其中186个位点具有多态性,多态位点百分率为83.78%,在种群水平上,多态位点百分率为80.18%～81.53%,平均为80.93%.期望杂合度、Shannon信息指数在物种水平上分别为0.3304和0.4834;在种群水平上分别为0.3089和0.4551,表明坛紫菜种群内存在着较高的遗传多样性水平,且在三个种群间没有明显差异.依据Gst值,坛紫菜的遗传变异主要发生在种群内的个体间(占93.5%),只有6.5%的遗传变异发生在种群间,由此说明坛紫菜种群间的遗传分化水平很低,这与坛紫菜种群间充分的基因交流(Nm=7.1930)是相关的.基于遗传距离的UPGMA聚类结果表明坛紫菜60个个体并不按照其地理分布进行分群,而是随机分群的.文章最后还对坛紫菜种质资源保护的必要性进行了讨论.     

罗非鱼微卫星DNA指纹图谱的构建

采用微卫星DNA指纹图谱技术对奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼和橙色莫桑比克罗非鱼进行品种鉴定和遗传多样性分析。从103对罗非鱼微卫星引物中筛选出82对多态性高、带型清晰稳定的引物，用这 82对引物检测3种罗非鱼的遗传结构，共检测到605个等位基因，平均等位基因数7.37个，数据经Popgen32计算和EXCEL工具作图，构建3种罗非鱼的DNA指纹数据库，并绘制了DNA指纹图谱模式图。结果显示，奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼和橙色莫桑比克罗非鱼的平均观测杂合度分别为0.179 6、0.530 1和0.312 2，平均期望杂合度分别为0.203 2、0.678 6和0.291 3，平均多态信息含量分别为0.075 4、0.608 3和0.152 8，由此可见，尼罗罗非鱼群体的遗传多样性水平最高，奥利亚罗非鱼群体遗传多样性最低。同时筛选得到16对具特异性条带的核心引物组合可将3种罗非鱼完全区分，每个位点可在其中一种罗非鱼中扩增出独有的条带，从而将这种罗非鱼与其它两种区分开来，将16对特异引物的图谱数据转化成计算机可以识别的数码指纹，可以方便地应用于罗非鱼及其杂交种的鉴定研究。为解决罗非鱼品种混杂遗传渐渗问题和保护罗非鱼种质资源提供技术支撑。     

坛紫菜遗传连锁图谱的构建

以野生型坛紫菜纯系(♀)和红色型坛紫菜纯系(♂)作为杂交亲本,结合四分子分析法及单个体细胞克隆的丝状体途径,创建了由157个株系组成的坛紫菜DH作图群体,并用经过筛选的24对SRAP引物和16对SSR引物对父母本及作图群体各株系进行双标记分析,获得了224个多态性标记,其中157个标记符合孟德尔分离规律。根据标记间的连锁规律,首次构建了坛紫菜的分子遗传连锁图谱,所构建的遗传图谱由包含124个标记(含SRAP标记104个,SSR标记20个)的5个连锁群组成,总长度为879.2cM,平均标记间隔为7.09cM,各个连锁群长度为134.2～213.6cM,包含标记18～31个。最后采用3种不同方法计算得到坛紫菜的估计基因组长度平均为955.3cM,由此得到坛紫菜遗传连锁图谱的基因组覆盖率为92.0%。     

文蛤30个微卫星标记的开发及在斧文蛤和帘文蛤

利用磁珠富集法构建的基因组文库和EST文库开发了30个文蛤多态性微卫星标记。8个G-SSR和22个EST-SSR多态性位点共获得140个等位基因,平均等位基因数为4.67,多态性信息含量、观测杂合度、期望杂合度分别介于0.172~0.744、0.040~0.720、0.187~0.793之间;G-SSRs的平均等位基因数、平均多态性信息含量、平均观测杂合度和平均期望杂合度都较EST-SSRs高;Hardy-Weinberg平衡检测发现,24个位点偏离了平衡状态;利用BLASTx对含多态性SSR位点的EST进行功能注释,11个位点来自注释基因序列。 将30对文蛤多态性SSR引物分别在斧文蛤和帘文蛤中进行了通用性检测,通用率分别为30%和40%。这些微卫星多态性位点的获得,为进一步开展文蛤遗传多样性分析、种质资源评价、分子标记辅助选育等奠定基础,并且可用于文蛤、斧文蛤和帘文蛤的比较作图、基因发掘和QTL定位等研究。     

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用，对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析，结果发现扩增的片段长度在1 208~1 219 bp之间，可以分为ITS1区，5.8S区和ITS2区3个部分，其中5.8S区片段的长度完全一致，均为160 bp；ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近，只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区（包括ITS1和ITS2）序列都存在一定差异，序列同源性在95.82％~99.73％之间，而5.8S区序列则完全一致，但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异，序列同源性在79.7％~95.0％之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。     

细基江篱及坛紫菜太空诱变遗传变异的RAPD分析

细基江蓠(Gracilaria tsengiana)及坛紫菜(Porphyra haitanensis)经过卫星搭载送入太空,进行太空诱变试验,返回地面后采用RAPD技术对其基因组DNA多态性进行了检测.筛选出16个随机寡核苷酸引物进行扩增,其中细基江蓠检测出93个位点,多态位点31个,占33.3%;坛紫菜检测出84个位点,多态位点19个,占22.6%;分子量在150～2500 bp之间.遗传相似系数用Nei的计算方法进行计算,遗传距离则用Lynch的计算方法进行计算.实验数据表明:经过太空诱变的群体与正常对照组相比,从整个基因组角度来看,其遗传多样性差异并不明显,但是太空诱变使部分位点的基因产生了较为显著的变异.研究结果证实:太空诱变能够不定向地促进基因的变异,是水产新品种选育的途径之一.     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响

通过围隔实验比较罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP)、罗氏沼虾+浮萍(水面覆盖率5%)(PP)、罗氏沼虾+鲢(PF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+鲢(PMF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢(PMPF)。养殖64 d后,测定不同模式中浮游植物和三大类浮游动物(轮虫、枝角类及桡足类)的种类和数量。结果显示,上述6种模式中浮游植物共同优势种有4种,但优势度指数最大的浮游植物不同,MP组是锥囊藻属,有浮萍的PP和PMP组均为细小平裂藻,混养鲢的PF、PMF和PMPF组均为针杆藻。不同养殖模式无共同的浮游动物优势种。养殖模式对浮游生物密度具有显著影响,PF组浮游植物密度最高,MP组浮游植物密度最低,PF组浮游植物密度比MP、PP和PMP组分别高78%、53%和61%。相反,浮游动物密度MP组最高,PF组最低。混养鲢的PF、PMF和PMPF组浮游动物密度显著低于其他3组。研究表明,罗氏沼虾养殖中混养鲢可增加浮游植物密度而降低浮游动物密度,浮萍和鲢影响池塘优势种。     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

Use of Microbacterium sp. and Exiguobacterium mexicanum to improve the survival and development of Artemia under xenic conditions

The effect of Microbacterium sp. strain 8L and Exiguobacterium mexicanum strain 8N was evaluated in the diet of Artemia under xenic conditions. Viable cultures of bacteria were provided to xenic cultures of Artemia in combination with Sacharomyces cerevisiae, cornflour or Spirulina, and the effect on the survival and growth was recorded. The use of these bacterial strains improves significantly the survival of Artemia independently of the used food (P < 0.05), and variable results were observed in the growth.     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

Movement of the fluvial form of masu salmon, <Emphasis Type="Italic">Oncorhynchus masou masou</Emphasis>, in a mountain stream in Kyushu,Japan

Using mark-recapture methods, the movements of the fluvial form of masu salmon (Oncorhynchus masou masou) in a mountain stream on the island of Kyushu, Japan, were studied. Most (78%) of the masu salmon were recaptured in the pool in which they had been originally caught and tagged. Of those that moved between pools, the proportion of individuals that moved during the breeding period was not significantly higher than the proportion that moved during the non-breeding period. However, during the breeding period, a higher proportion of larger salmon moved than did smaller fish. The proportion of mobile large males during breeding period was higher than that for small males. Also, it was found that a few individuals showed long-range movement in the autumn. As a long-term movement, 78 individual fish (65%) that were recaptured more than three times showed high sedentary tendencies. Sixteen individual mobile fish (13%) moved and returned to the original pool. Fluvial form of masu salmon in Kyushu show a high sedentary nature; however, large mature males seem to actively move in search of female during breeding period.     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。